VL 13: Genregulation I: Transkriptionsregulation Flashcards
1
Q
Regulation der Genaktivität bei Eukaryoten
A
- Zeiträume
- Kurzfristig: Reaktion auf veränderte Bedingungen
- Langfristig: Zelldifferenzierung
- positiv, aktivierend
- Negativ, reprimierend
- An unterschiedlichsten Teilschritten der Genexpression
2
Q
Teilschritte der Genexpression
A
- Regulation kann auf allen Etappen vom Gen bis zum Protein erfolgen
- RNA Regulation wegen der höheren Halbwerrtszeit in Eukaryoten im Vergleich zu Prokaryoten wichtiger
- Meistens auf Ebene Transkription
3
Q
Was ist Regulation
A
- Regulation von Was?
- DNA? mRNA? Protein?
- Biologisch relevant ist aktives Protein
- Was ist der ratenlimitierende Schritt für Produktion des untersuchten Moleküls?
- Welcher Schritt
- Regulation kann auf Ebene der DNA Menge geschehen,
- Obwohl wir denken, dass DNA unveränderlich ist
- RNA-Regulation wegen der höheren Halbwertszeit in Eukaryoten im Vergleich zu Prokaryoten wichtiger
4
Q
John Gurdon Experiment, erste Klone
A
- Zwei Froscharten
- Frog A
- Ei, zerstoert Kern → intaktes Ei ohne genetische Information
- Frog B
- Kernisolierung aus differenzierter Zelle
- Frog A
- isolierter Kern von Frog B wird in kernlose Eizelle von Frog A implantiert
- neuer Frosch → Klon von Frosch B
- alle Zellen in einem Organismus enthalten die gleiche Anzahl von Genen
5
Q
Regulation der Gendosis
A
- In einigen Fällen werden bei der Differenzierung von Zellen und Geweben Gene entfernt, die nicht benötigt werden, oder amplifiziert, wenn viel Genprodukt gebraucht wird
- Zellen, die eine vervielfachung der rDNA erreichen
- in Eizellen werden gewaltige Mengen an rDNA produziert
- Beispiel: Zellkern, Froschoozyte
- Gene für rRNA werden durch Rolling-Circle-Replikaiton amplifiziert und bilden Extranukleoli(viele Nukleoli) – ca. 1000-fache Vermehrung der rRNA Gene → viele Ribosomen
- Beispiel: Oozyte des Gelbrandkäfers
- Amplifizierter DNA-Ring mit fünf Transkriptionseinheiten für rRNA
- DNA Menge ist ratenlimitierend
- Besonderheit Ciliata: amplifizieren selektiv ihr Genom (im Macronukleus)
6
Q
Ciliata Regulation Gendosis
A
- Amplifizieren selektiv ihr Genom (im Macronukleus)
-
Micronukleus
- Kern fuer Sexualitaet verantwortlich
- werden waehrend Fusion v zwei Ciliaten fusioniert, Rekombinationsprozesse → Verteilung der Chromosomen auf Tochterzellen
- Chromosomen chaotisch aufgebaut
-
Macronukleus
- Exekutionsform der DNA
- heterochromatisch, wird nicht transkribiert
- Gene werden aus dem Nukleus nach Bedarf amplifiziert
- geordneter
- Amplifizierte Kern (1000fach)
- Größer
- mRNA
7
Q
Positive und negative Regulation der Transkription durch Proteinfaktoren
A
- Gene sind in unterschiedlichen Zellen unterschiedlich transkriptionsaktiv
- Z.B. Leber-cDNA-Proben in Nieren- und Gehirn-RNA nicht aktiv (in Leber-RNA schon)
- Andere cDNA Proben (Aktin, tRNA, etc.) in allen drei aktiv
8
Q
Positive Kontrolle: Galaktoseabbau in Hefe, Gal4 als Aktivator
A
- Wenn Glucose vorhanden ist, wenn die obigen Gene nicht produziert à Gal4 inaktiv
- Mel1: Galactosidase: Spaltet
- Gal2: bring Galactose in Zelle rein, Permease, Transporter
- Gal1: Kinase: macht Galactose reaktiv
- Gal 7: Uridyltransferase:
- Gal10: Epimerase:
- Galactose à Glucose
9
Q
Gal 4
A
- reguliert Gal1, Gal7 und Gal10
- Liegen nebeneinander auf Chromosom II
- Von verschiedenen Promotoren abhängig
- Gal 4 bedient alle Promotoren
- Gal 4 Aktivierung erfolgt über wweitere stromaufwärts gelegene Proteine
- Gal 80: Repressor Gal4
- Gal 3: Repressor des Repressors
- Galaktose: Aktivator Gal 3
10
Q
Gal 4 Struktur
A
-
Dimer
- 2 Gal4 Proteine
- DNA-bindene Domäne
- aktivierende Domäne (aktiviert DNA-Polymerase)
- beide Domänen können getrennt werden und trotzdem aktiv sein
- Gal4 bindet als Dimer an die major groove der DNA an gegenüberliegenden Seiten (typisch für TFs)
- Zink-Finger-Protein
- Zn2+-Ion
- Bildet Komplex mit 2 Cys und 2 His
- Gal4 hat mehrere Zinkfinger
11
Q
**Gal 4 Bindestelle und Kofaktoren
A
12
Q
Transkriptionsfaktoren
A
-
2 Domänen idr
- DNA-binde-Domäne
- Aktivierungsdomäne
- Bilden Dimere aus
- Homodimere/Heterodimere
- Die Dimerisierung erhöht die Anzahl von DNA-Zielen und Aktivierungsmodi
- 2600 TFs im menschl. Genom
- 1/10 Kodierungskapazität!
- diese Regulationsart sehr wichtig!
13
Q
TF Bindung an DNA
A
- Passen zumeist in die major groove der Doppelhelix
- 33 Angröm/ 11 bp zwischen den Zentren der DNA-Bindestellen
- TFs binden an anderen Strängen
14
Q
Typen von DNA-bindenden Domänen
A
-
Helix-turn-Helix (dominierende Familie in Bakterien)
- Homeodomain
- Zinkfinger – dutzende Subtypen
- Leucin-zipper/basischer Zipper (bZip)
- Basische helix-loop-helix
15
Q
Leucin Zipper
A
- TF: AP1 → Regulation der Produktion von Wachstumfaktoren (Cytokine, TGFbeta)
- Heterodimer Untereinheiten
- Jun
- Fos
- Teil der langen Helices reichen in DNA hinein
- Andere Teil verkleben über Leucine
*
16
Q
Helix-Loop-Helix
A
- MyoD → Regulation der Produktion von … wichtiger Faktor in der Entwicklung von Muskelzellen aus Muskelvorläufern
- Loop unskrukturierter Aminosäuren
- Lange Helix für Dimerisierung
- Helix die Kontakt aufnimmt
22
Q
Hefe Zwei Hybrid System
A
- Identifikation von Protein-Protein-Interaktionen
- Separation der Aktivator- und DNA-Bindedomäne eines TFs (z.B. Gal4)
- Hybridisierung DBD mit einem bait/Köder (BaitProtein) (in diesem Fall RNA-Bindeprotein) durch Translationsfusion
- AD hybridisiert mit vielen verschiedenen Proteinen (Beuteproteinen), von denen wir wissen möchten ob sie mit Köder interagieren, vlt mit ganzem Proteom (von Pflanzengenom/Mausgenom/Krokodil/etc.)
- Ziel: Herausfinden welches Protein mit bait interagiert
- Wenn bait und Protein miteinander interagieren wird vollständiges TF hergestellt
- Transkription der Reportergene findet statt
24
Q
Repression der Transkription - Typen
A
- Konkurrenz von Aktivator und Repressor um Bindestelle (a)
- Repressor bindet (und inaktiviert so) Aktivator = Inhibition (b)
- Repressor inaktiviert generellen Transkriptionsfaktor (c)
- Dicht-gepacktes Chromatin
- Direkte Bindung des Repressors mit Operator-Sequenz, die mit Sigmafaktor und RNA-Polymerase bindet à direkte Kompetition (aber selten in eukaryoten))
25
Q
Beispiel für negative Kontrolle: Galaktoseabbau in Hefe, Mig 1 alss Repressor
A
- Mig1 verhindert, dass Gal4 exprimiert wird und andere Gene
- Aktiv, wenn viel Glucose vorhanden (da Galactoseabbau dann nicht notweendig ist)
- Glucose schaltet Kinase aus bei hoher Konzentration
- Mig1 liegt unphosphoryliert vor
- Mig 1 kann von Cytoplasma ins Kern wandern
- Repression
- Mig1 wird über eine Glucose-abhängige Kinase phosphoryliert und damit deaktiviert
- Doppelte Repression
29
Q
Hormonrezeptor-Transkriptionsfaktoren
A
- Binden Hormone und ermöglichen so Import in ZK
- Dazugehörigen TF/Kernrezeptoren besitzen unterschiedliche Längen, da v.A. variable Domänen in ihren Längen variieren
- Jeder hat sein eigenes DNA-Zielelement
- DNA-Bindedomäne ist Cys-Cys Zinfinger Paar
- Wandern in Kehren ein
- Ligand-Bindedomäne
- Konserviert, da die Metabolite ähnliche Struktur haben
- Binden an Metabolite
- DNA-Bindedomäne
- Hoch-konserviert
- Bindet DNA
- Spezifisch – Jeder hat sein eigenes DNA-Zielelement
- Ist ein Cys-Cys Zinkfinger-Paar
- Der 1. Finger bindet DNA
- Kurze Region in Fingr 1 bestimmt DNA-Bindespezifität (P-box)
- Der 2. Finger führt zur Dimerisierung D-Box)
- Der 1. Finger bindet DNA
- Variable Domäne
- Nicht konserviert
- Variabel, v.a. in der Länge
- Aktivierungsdomäne
31
Q
Zielsequenzen der Hormonrezeptoren
A
- Jeder Hormonrezeptor hat eigenes DNA-Zielelement
- TF wirken als Dimere (Homo/Hetero)
- Zielsequenze entsprechend
- ca. 6 nt
- verdoppelt vorliegend
- Homodimer: palindromisch an Anfang und Ende der Sequenz
- Heterodimer: Sequenz unter Umstaenden komplexer
- direkter repeat
- ¨ähnlich
33
Q
Wirkungsweise hormonrezeptor
A
- Bindung des Hormons erlaubt Import in den Zellkern
- Rezeptor binden im Cytosol Ligand (Hormon) à Konformationsänderung
- Kann in Kern importiert werden
