Analys av ak/ag för immundiagnostik

Question 1

Vilken egenskap hos antigenen krävs för att antikropparna ska kunna bilda korsbindningar och skapa stora nätverk/immunkomplex?

Answer 1

Att antigenen har fler än ett bindningsställe

Question 2

Vad innebär agglutination?

Answer 2

Antikroppsmedierad ihopklumpning av olösliga större partiklar tex bakterier, celler eller plastkulor täckta av antigener

Question 3

Vad innebär precipitation?

Answer 3

Antikroppsmedierad utfällning av lösliga molekyler. Korsbindning av lösliga antigener + antikroppar bildar ett synligt precipitat

Question 4

Hur går en direkt agglutionationsreaktion till? Ge exempel på när detta används

Answer 4

Antigenspartiklar + korresponderande antikroppar –> Synlig agglutination

Tex blodgruppsbestämning

Question 5

Hur går en indirekt agglutionationsreaktion till? Ge exempel på när detta används

Answer 5

Lösligt antigen sätts på partiklar (tex kulor/beads), sedan tillsätts korresponderande antikroppar –> synlig agglutination

Tex TPPA (treponema pallidum particle agglutination assay)

Question 6

Vad är principen för TPPA?

Answer 6

Antikroppar mot gelatinpartiklar täckta med syfilisantigen mäts i en spädningsserie

Question 7

Beskriv radiell immunodiffusion (Mancini)

Answer 7

Antigenspecifik antikropp ingjuten i gel. Till brunnar i gelen tillsätts antigen och när antigenet diffunderar ut i gelen bildas en synlig utfällning.

Arean på utfällningscirkeln är proportionell mot antigenkoncentrationen i provet

Question 8

Beskriv dubbel immunodiffusion (Ouchterlony)

Answer 8

En semikvantitativ äldre metod som fortfarande används. Kan användas för att detektera antikroppar mot en stor mängd olika antigener. Om patienten har antikroppar mot allergenet bildas en utfällningsreaktion som syns tydligt efter Coumassiefärgning

Question 9

Vad färgar Coumassiefärgning? Vilken färg?

Answer 9

Proteiner färgas blå

Question 10

Definiera turbidimetri

Answer 10

Minskning av ljusgenomsläpplighet per tidsenhet

Question 11

Definiera nefelometri

Answer 11

Ökning av ljusspridning per tidsenhet

Question 12

Vad är “solid phase immunoassays”?

Answer 12

Immunoassays i vilka antigen eller antikropp är bundna till en fast fas så som botten på en ELISA-platta eller en plastkula medan de andra reaktanterna är fria i lösning

Question 13

Vad är fördelarna av sandwich-ELISA?

Answer 13

Fördelar:
Relativt enkel metod
- Kräver endast spektrofotometer (absorbansmätning) som finns på de flesta laboratorier
- Resultat erhålls snabbt från relativt enkla analysprogram
- Relativt enkelt att själv etablera ny metod
- Relativt billig metod – särskilt egenutvecklade metoder
- Kan vara en känslig metod (inte alltid)

Question 14

Vad är nackdelarna av sandwich-ELISA?

Answer 14

Nackdelar:

• Analys av ett protein i taget
• Relativt tidskrävande (3h-48h)
• Relativt stora provvolymer krävs – särskilt om flera olika proteiner ska analyseras i samma prov
• Känsligheten kan ibland vara för låg för att kunna detektera alla biologiska analyter

Question 15

Ge exempel på några ELISA-metoder som används inom klinisk immunologi (alltså inte olika sorters ELISA, utan vad de används för)

Answer 15

• Anti-Neutrophil Cytoplasm Antibodies (ANCA)
• Anti Nuclear Antibodies (ANA)
• Cytokiner (IL-2, IFN-J etc)

Question 16

Beskriv ImmunoCAP

Answer 16

En ELISA-liknande automatiserad metod som används för analys av allergenspecifika antikroppar (ffa IgE) för att diagnosticera allergier. Analysen visar vilket allergen som patienten reagerar på.

Question 17

Vad är syftet med att analysera allergenkomponenter (delar av antigen) vid ImmunoCAP?

Answer 17

Det kan bidra till bedömningen av allergins svårighetsgrad då vissa delar ger svårare reaktion än andra.

Question 18

Vad innebär hydrodynamisk fokusering?

Answer 18

Kulor passerar genom flödescellen och lasern en och en

Question 19

Hur går den kulbaserade flödescytometriska multiplexanalysen till?

Answer 19

Färgade kulor med bundna antigen + detektionsantikroppar passerar en och en förbi flödescellen+lasern. Fluorescensen från både kulan och de fluorokrominmärkta detektionsantikropparna analyseras

Question 20

Vilka fördelar finns med kulbaserad flödescytometrisk multiplexanalys?

Answer 20

Fördelar:
- Möjligt att göra multiplexanalys av många proteiner samtidigt (2-500)
- Sparar tid
- Sparar provvolym (25-50 μl krävs totalt för samtliga analyser)
- Ger relativt breda analysintervall – behöver inte göra många olika
spädningar av prov

Question 21

Vilka nackdelar finns med kulbaserad flödescytometrisk multiplexanalys?

Answer 21

Nackdelar:

• Relativt hög analyskostnad per prov (men ganska billigt per protein som analyseras)
• Kräver tillgång till flödescytometriskt instrument och analysprogram
• Kräver viss analysspecifik kunskap/träning (instrument och analys)

Question 22

Beskriv metodprincipen för hur låg vs hög koncentration påverkar PE-signalen

Answer 22

Prov med låg koncentration leder till låg mängd bundet IL-6 (tex) till varje kula och därmed låg mängd bundet detektionsantikropp och låg PE-signal (fluorescens).

Prov med hög koncentration ger istället högre mängd bundet IL-6 till varje kula och därmed hög PE-signal (fluorescens).

Question 23

Vad visar kulans färg respektive PE?

Answer 23

Kulans färg anger vilken analyt som detekteras, medan PE (signalen från antikroppen) anger hur mycket analyt som bundit till respektive kula

Question 24

Hur bestämmer man koncentrationen i provet (kulbaserad multiplexanalys)?

Answer 24

Man använder standardkurvor (fluorescens x koncentration) och jämför fluorescensen hos det okända provet med standardkurvan för att avläsa koncentrationen

Question 25

Vad är analysprincipen för Luminex?

Answer 25

Med hjälp av beads med olika klassifikationsfärger (CL) så kan 2-500 proteiner analyseras samtidigt.

Question 26

Vad är analysprincipen för ANA-screen?

Answer 26

Till magnetisk, fluorescensmärkt kula kopplad till antigen tillsätts serumprov. Antigenspecifika serumantikroppar binder till antigenen och sedan tillsätts fluorokrommärkta anti-IgG antikroppar och sedan analyseras provet i FACS

Question 27

Vad betyder ANA?

Answer 27

AntiNuclear Antibodies - antikroppar som bildas mot antigen(er) som finns i cellkärnorna

Question 28

Vilka sjukdomstyper associeras ANA med? Ge även några exempel på specifika sjukdomar.

Answer 28

ANA associeras med systemisk bindvävs-/autommuna/inflammatoriska sjukdomar. Tex SLE, Sjögrens…

Question 29

Eftersom ANA är en screeningmetod måste positivt utfall verifieras. Med vilka metoder görs detta?

Answer 29

ELISA, Immunofluorescens, immunoblot mm

Question 30

Vad är skillnaden på kvalitativ, kvantitativ och semikvantitativ?

Answer 30

Kvalitativ besvarar frågan “Finns det?” med JA/NEJ

Kvantitativ kan ge ett exakt värde för hur mycket som finns

Semikvantitativ kan beskriva om det finns lite eller mycket

Question 31

Beskriv immunofluorescens (direkt, indirekt, syfte)

Answer 31

Syfte: att upptäcka antikroppar mot “okända” antigener

Direkt: Till ett vävnadsprov med bundet antigen tillsätts fluorokrommärkta detektionsantikroppar

Indirekt: Till ett vävnadsprov med bundet antigen tillsätts först en omärkt antikropp och sedan en fluorokrommärkt anti-Ig detektionsantikroppar.

I båda fallen görs sedan en bildanalys med mikroskop

Question 32

När man gör ANA-analys med immunofluorescens, vilka saker tittar man på?

Answer 32

Mönster samt antikroppsnivåer (titer).

Exempel på provsvar: 400 Kornig

Question 33

Ge exempel på 4 ANA-IF mönster och beskriv dem

Answer 33

Homogen: jämn färg hela vägen genom
Kornig: Grön bakgrund, svarta korn
Centromerer: Mörk bakgrund, ljusa små prickar
Nukleolär: Mörk bakgrund, ljusa kärnor

Question 34

För varje mönster (ANA-IF), beskriv

• vad som bundits till
• vilken sjukdom det indikerar

Answer 34

Homogen:

• DNA > SLE,
• histoner > lkm-inducerad SLE

Kornig:

• SSA-SSB > Sjögrens, SLE
• Sm-RNP > SLE
• RNP > MCTD

Nukleolär: Scl-70: Sklerodermi

Centromer: sklerodermi (CREST)

Question 35

Vilka nackdelar finns med ANA IF?

Answer 35

Låga antikroppsnivåer finns hos friska människor (mer prevalent hos äldre)

Svårt att tolka mönster och titer (beroende på person, substrat,färgning, reagens, etc)

Låg specificitet (flera sjukdomar associeras med mer än ett mönster,
förutom centromer)