Proteiners sortering, veckning och nedbrytning

Question 1

Vad är endosymbiontteorin?

Answer 1

Teorin om hur eukaryota celler har uppstått.

1. En arké finns med löst DNA och har ett cellmembran.
2. Endocytos sker av arkéer som har mer/annat genetiskt material.
3. Endocytos sker av en aerob bakterie
4. Ett primärt kärnmembran uppstår genom invaginationer av plasmamembranet. Det skyddar DNA:t men håller det fortfarande tillgängligt från cytosolen. Samtidigt utvecklas den endocyterade aeroba bakterien till en protomitokondrie.
5. Dubbelt kärnmembran och en mitokondrie med mtDNA utvecklas helt.

Question 2

Vilka är cellens viktiga organeller?

Answer 2

• Kärna - med kromosomer och dubbelt kärnmembran
• ER
• Mitokondrier - med cristae för att öka den inre arean på mitokondriens inre membran
• Golgiapparaten - ett antal membranomslutna områden som har viss polaritet. Cis-golgi ligger närmast ER och trans-golgi ligger närmast plasmamembranet. Transport av proteiner till golgi från ER sker i vesiklar och transport från golgi till plasmamembranet sker i vesiklar längs cytoskelettet.
• Peroxisomen - bland annat oxidation av fettsyror
• Cytoskelettet - aktin- och mikrotubilifilament. Utgår från centrosomen med centrioler.
• Lysosom - nedbrytning av diverse saker.
• Extracellulärt matrix - proteiner utanför celle som den kan interagera med och binda till.

Question 3

Vad innebär topologibegreppet?

Answer 3

Det används framförallt att beskriva relationen mellan olika delar i sekretoriska och endocytiska vägen. Två områden är topologiskt ekvivalenta om de kan kommunicera så att molekyler kan röra sig mellan områden utan att passera ett membran. De delar som är topologiskt ekvivalenta i cellen är ER, golgi, vesiklar, lysosomer, endosomer och extracellulärt matrix.

Question 4

Hur är ER uppbyggt?

Answer 4

• Strävt ER som har ribosomer dockade till sig
• Slätt ER utan ribosomer och som är involverade i lipidsyntes
• ER-lumen dit proteiner tillverkade i strävt ER går in (ca 30nm brett.

Question 5

Hur är golgi placerat i förhållande till en cells rörelseriktning?

Answer 5

Framförcellkärnan - i rörelseriktningen

Question 6

Hur ser mitokondriens rörelse mönster ut och hur ser de ut över tid?

Answer 6

De rör sig via mikrotubili vilket gör att det finns ett överlapp mellan mitokondrier och mikrotubili om man färgar in dessa.

Mitokondrier är dynamiska över tid - rör sig och förändras. De kan också fusera med varandra.

Question 7

Vad gör peroxisomen?

Answer 7

En metabol organell som är inbland i olika oxidativa reaktioner. Den innehåller 50 enzym.

Question 8

Var startar proteinsyntes?

Answer 8

Vid fria ribosomer i cytosolen. Var de ska sorteras bestäms sedan av olika signalsekvenser.

Question 9

Vilka är de oliak typer av signalsekvenser som känns igen av olika receptorer?

Answer 9

• N-terminal: Den del som först kommer ut från ribosomen. Klyvs bort av signalpeptidas och finns inte kvar i färdigt protein efter transmembrantranslokation.
• Intern: del av färdigt protein, mer i mitten av proteinets primärsekvens (gated transport)
• C-terminal: del av färdigt protein (transmembrantranslokation)
• Kombination (ytmotiv): Från olika delar av primärsekvensen. Del av färdigt protein (gated transport, vesikulärt transport)

Question 10

På vilka sätt kan proteintransport ske in i olika organeller?

Answer 10

• Gated - kärnporskomplex
• Transmembrantransport
• Vesikulär transport

Även transport från endosomer och ER till cytosol.

Question 11

Hur ser signalsekvensen ut som signalerar för intransport av protein till mitokondriematrix?

Answer 11

Proteiner som ska transporteras in har en särskild signalsekvens som innehåller positivt laddade aminosyror arginin och lysin. När en alfahelix sedan bildas hamnar de laddade aminosyrorna på den ena sidan i en amfipatisk signalpeptid som kan bind till fickor på receptorerna.

Question 12

Hur sker intransport av protein till mitokondriematrix?

Answer 12

1. Ett precursorprotein har en signalsekvens som binder till en receptorprotein i det yttre mitokondriemembranet i TOM-komplexet. Till proteinet sitter cytosoliskt HSP70 bundet.
2. Proteinet går in genom en kanal i TOM till intramembranutrymmet. HSP70 klyvs bort i en energikrävande process.
3. Translokation till matrix genom TIM(23)-komplexet. För translokationen kräve energi i form av membranpotential. Insidan av matrix är negativt laddat och kommer attrahera proteinet. Till hjälp finns också mitokondriellt HSP70 som drar in proteinet genom att ändra konformation och fysiskt dra in proteinet - en ATP-krävande process.
4. Klyvning av signalpeptiden av signalpeptidas.
5. Slutgiltig veckning av mitokondrieproteinet då det måste vara oveckat då det går genom TOM och TIM.

Question 13

Hur sker proteinimport till peroxisomer?

Answer 13

1. Proteinet har en särskild C-terminalsekvens kallad PTS1 (peroxisomal-targeting sequence)
2. Binder till pex5-receptorn som finns i cytosolen.
3. Pex5 binder till pex14 i perisommembranet.
4. Konformationsändring gör att proteinet skicas in i peroxisomen tillsammans med pex5.
5. Protein-receptorkomplexet dissocierar och pex5 går ut i cytosolen igen genom ett komplex med pex2, pex10 och pex12.

Question 14

Hur sker veckning av protein då de bildas?

Answer 14

Redan under translationen innan proteinet är klart kommer N-terminaldomänen att börja vecka och sedan när translationen är nästan klar kommer C-terminaldomänen att börja veckas. Den slutgiltiga sekundärstrukturen och tertiärstrukturen kommer att antas först då proteinet har släppt från ribosomen.

Veckning kommer framförallt att avgöras av minimering exponering av hydrofoba ytor.

Question 15

Vilka är de olika HSP-chaperonerna som finns?

Answer 15

• HSP70 - finns i cytosol, mitokondrier och ER
• HSP60 - finns i cytosol och mitokondrier
• HSP90 - finns i cytosolen.

Question 16

Vad händer om proteinet är felveckat?

Answer 16

Proteinets form är kopplat till dess funktion vilket kan leda till proteinaggragation (stress). Detta kan vara toxiskt för cellen.

Question 17

Hur fungerar HSP70 i en situation med värmechock eller annan stress?

Answer 17

1. Korrekt veckade proteiner utsätts för något som leda till felveckade proteiner
2. HSP70 sitter i vanliga fall bundet till HSF1 som är en transkriptionsfaktor men släpper nu och binder in till felveckade protein.
3. Det leder till mer fritt HSF1 i cellen som går in till kärnan genom kärnporer
4. HSF1 oligomeriserar till vissa områden som gör att transkription börjas av gener som kodar för fler chaperoner. Translation sker.
5. Mer HSP70 bildas som kan binda in till fler felveckade proteiner och hjälpa dem att veckas rätt
6. Då proteinstressen minskar kommer det ha kommit upp till en transkriptionsnivå av HSP70-genen så att det kommer finnas tillräckligt med HSP70 att binda upp HSF1 vilket kommer att minska transkriptionsnivån till det normala.

Question 18

Hur fungerar Hsp60?

Answer 18

Det veckar om felveckade färdiga protein och finns i både cytosolen och mitokondrien. Den kan till formen liknas med en tunna med många hydrofoba ytor på insidan. Detta kommer att fånga upp och dra in det felveckade proteinet och vecka upp det. Med hjälp av ATP kommer ett lock att attraheras - GroES cap. Då har proteinet runt 10 sekunder att vecka sig rätt innan ATP hydrolyseras och det förhoppningsvis korrekt veckade proteinet skjuts ut.

Dessa veckar upp till 30% av proteinerna i cellen.

Question 19

Hur sker polyubiquitinylering?

Answer 19

Det märker upp proteiner och ger en signal för nedbrytning. Flera ubiquitin sätts på särskilda lysinsidokedjor i proteinet. Ubiquitinligaskomplexet bestående av tre enzym utför processen. Bindningen sker till ε-aminogruppen på lysinsidokedjan efter att proteinet har bundit in till komplexet.

Question 20

Hur kan aktivering av ubiquitinligaskompexet ske?

Answer 20

Det finns många olika komplex som alla behöver aktiveras på samma sätt, dock alla via E3.

• Fosforylering av proteinkinas
• Allosterisk omvandling orsakad av ligandbindning

Question 21

Hur kan en proteins nedbrytningssignal skapas/exponeras, som sedan känns igen av ett ubiquitinligas?

Answer 21

• Fosforylering
• Avtäckning genom proteidissociering efter att två proteiner som tidigare varit sammanbundna.
• Skapande av en instabil N-terminal

Question 22

Hur proteasomen ut och hur fungerar den?

Answer 22

Det är ett proteinkomplex bestående av flera proteinsubenheter. Det är format som en cylinder med ett rör där proteinet går in.

• Caps på ändarna som har en ubiquitinreceptor som gör att proteasomen kan binda in selektivt till ett protein. Bredvid sitter ett ubiquitinhydrolas som kan bryta ner ubiquitinkedjan. Under finns en unfoldasring vilket är en ringformad ATPas som veckar upp proteinet så att det kan matas in i proteasomen.
• Centralcylinder som är ett proteas. Ligger precis under unfoldasringen och består av proteasomens aktiva site. Där bryts proteiner ner till peptider som sedan kan brytas ner till aminosyror av cytoplasmatiska peptidaser.

Question 23

Hur hoppas proteasomer kunna användas inom medicinen?

Answer 23

Det hoppas kunna användas för targeting och nedbrytning av muterade protein som skulle kunna leda till sjukdom. Ett sådant exempel är PROTAC som binder in målprotein och för dem samman med ubiquitinligaskomplexet så att polyubiquitinylering kan genomföras.

Question 24

Vilka två huvudprinciper finns för proteintranslokation över ER-membranet?

Answer 24

• Cotranslationell translokation - vilket sker samtidigt som translation i en ER-bunden ribosom.
• Posttranslationell translocation efter att proteinet har translaterats av en fri ribosom.

Question 25

Hur sker cotranslationell translokation av proteiner till ER?

Answer 25

En fri ribosom med en påbörjad translation av ett protein med en ER-signalsekvens känns igen av SRP (signal recognition particle). SRP binder in till proteinet och dockar det till en SRP-receptor i ER-membranet.

Question 26

Hur ser SRP ut och hur binder det in till ribosomen?

Answer 26

Det består av 6 protein och en RNA-molekyl. Den binder in dels till signalsekvensen och dels till ytan på den stora subenheten. Det gör att translationen temporärt stänger av. Samtidigt som den binder in exponeras en till yta som gör att komplexet kan binda in till dess receptor.

Question 27

Vilken är grundprincipen för proteinsortering till olika organeller?

Answer 27

Signalsekvenser i protein känns igen av specifika receptorer och detta möjliggör sortering och specifik transportväg och var proteinet slutligen hamnar.

Question 28

Hur sker inbindningen av SRP till en specifik SRP-receptor på ER?

Answer 28

1. Signalsekvens på en växande peptid
2. Igenkänning och bindningen av SRP till signalpeptid orsakar paus i translationen.
3. Targeting och inbindning till SRP-receptorn och en proteintranslokator.
4. Dissociation av SRP-receptorn och proteintranslokatorn sker. Bunden till proteintranslokatorn fortsätter translation och tanslokation börjar. SRP fortsätter vara bunden till dess receptor i ER-membranet.
5. Recykling sker då SRP släpper från receptorn och kan då binda in till ett nytt ribosomkomplex.

Question 29

Hur sker translokation av ett membranprotein?

Answer 29

Proteinet har så många start och stopp-transfersekvenser som antalet gånger som proteinet ska gå över membranet. Först går starttransfersekvensen närmast N-terminalen in i translokatorn och sätts vid sidan av translokatorn. Sedan fortsätter proteinet in tills den hydrofoba stoptransfersekvensen går in i translokatorn. Då samtliga start/stopsekvenser som ska vara associerade i membranet har gått igenom kommer translokationen upphöra och proteinet skjuts ut ur proteintranslokatorn.

Om det är ett single-pass transmembranprotein kommer ett signalpeptidas att klyva bort startsekvensen så att proteinet bara är associerat med membranet på ett ställe.

Question 30

Hur styrs vilken av proteinterminal som hamnar i ER-lumen och vilken som är ute i cytoplasman?

Answer 30

Förekomst av positiva aminosyror vid signalsekvensen. Den sida om signalsekvensen som har positivt laddade aminosyror kommer att hamna i cytosolen.

Question 31

Vilka är mekanismerna som finns för transport av transmembranprotein till kärnmembranet och hur fungerar de?

Answer 31

Alla proteiner är märkta med NLS - nuclear localization sequence - som vetter ut mot cytoplasman.

• Proteinet tas upp i en vesikel som kan färdas til det inre membranet. NLS kommer då att hamna inåt mot kärnans matrix.
• Fri diffusion genom att glida in i spalten som finnsn mellan kärnporkomplexet och membranet. Denna transportväg är ospecifik.
• Transport via kärnporen tillsammans med en importreceptor som binder till proteinet. Väl inne i kärnan släpper importproteinet och går tillbaka ut till cytosolen via kärnporen.

Question 32

Hur ser N-länkad glykosylering ut?

Answer 32

Glukosen sitter bunden till en NH-grupp i aminosyran så att en N-acetylglukosamin bildas.

Question 33

Hur ser O-länkad glykosylering ut?

Answer 33

Glukosen sitter länkad till ett syre i aminosyran.

Question 34

Hur sker N-glykosylering?

Answer 34

Glukosen överförs on block (i ett stycke) från en lipidlänkad oligosackarid som sitter i ER-membranet. Den kopplas till proteinet mha oligosackaryltransferas. Det som gör att proteinet kan binda in till enzymet är acceptorsekvensen Asn-X-Ser/Th.

Question 35

Vilka är funktionerna av N-glykosylering?

Answer 35

• Veckningskontroll av protein
• Lokalisering/transport av protein genom att ändra affinitet
• Proteinaktivitet
• Stabilitet genom att skydda mot nedbrytning
• Löslighet ökar eftersom oligosackarider är vattenlösliga.

Question 36

Hur fungerar processen med veckningskontroll i ER och N-glykosylering?

Answer 36

1. Ett oveckat protein länkas till en precursoroligosackarid
2. Glukostrimning sker tills endast en glukos är bunden till proteinet.
3. Molekylen kan binda in till chaperonen calnexin som hjälper det att veckas rätt.
4. Glukosidas klyver glukosen så att proteinet tappar affinitet för calnexin. Det kan finnas kvar en N-länkad oligosackarid.
5. Om veckningen lyckades kan proteinet lämna ER. Annars binder den till glykosyltransferas som genom UDP-glukos binder upp en ny glukos till proteinet. Proteinet kan då igen binda till calnexin och möjligen veckas rätt.

Question 37

Hur sker retrotranslokation?

Answer 37

Det syftar till export och nedbrytning av felveckade protein i ER.

1. Om ett felveckat protein inte lyckas veckas rätt så kommer denna att samla på sig flertalet bindare - olika chaperoner, disulfidisomera och lektin.
2. Samlingen kan då binda till ett proteintranslokatorkomplex
3. Samtidigt som translokation sker kommer ubiquitinligaskomplexet att polyubiquitinyleras.
4. N-glykanas spjälkar bort oligosackarider.
5. Nedbrytning i proteasom

Question 38

Vad gör det oveckade proteinsvaret och vilka vägar finns det?

Answer 38

Motverkar ackumulering av oveckade protein genom att på olika sätt aktiverar transkription av gener för att öka proteinveckningskapaciten i ER.

1. IRE1
2. PERK
3. ATF6

Question 39

Hur går IRE1-BIP-axeln av det oveckade proteinsvaret?

Answer 39

1. Någon sorts överlastning eller värmechock leder till felveckade protein och stress.
2. IRE3 och BIP sitter vanligen bundna tillsammans i ER-membranet men BIP släpper för att binda in till felveckade protein.
3. Att BIP släpper möjliggör dimerisering av fira IRE1-protein, följt av autofosforylering och aktivering av IRE1-ribonukleas som kan utföra splicing av pre-mRNA XBP1.
4. Det mogna XBP1 mRNA:t translateras i fria ribosomer till XBP1-protein vilket är en transkriptionsfaktor.
5. XBP1 går in i kärnan där det binder till gener som kodar för chaperoner - bland annat BIP
6. Mer BIP translateras och går in i ER
7. Mer BIP och andra chaperoner motverkar stress och IRE1 stängs av vid BIP-bindning igen då det finns tillräckligt med BIP.

IRE1 kommer att inaktiveras av fosfataser och att dimeriseringen försvinner.