Brainscape's Knowledge GenomeTM

Browse over 1 million classes created by top students, professors, publishers, and experts.


See full index

BMA043 Molekylärbiologisk metodik > Genkloning (bakterier), restriktionsenzym, plasmider, DNA-elektrofores > Flashcards

Genkloning (bakterier), restriktionsenzym, plasmider, DNA-elektrofores Flashcards

1
Q

Definiera “kloning”

A

Kloning innebär skapandet av genetiska kopior av en individ/cell/gen.

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
2
Q

Vilka sorters artificiell kloning finns det? (3st)

A
  • Reproduktiv kloning (kloning i äggcell)
  • Terapeutisk kloning (stamceller)
  • Molekylär kloning (genkloning)
How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
3
Q

Nämn de 4 övergripande stegen för molekylär kloning av humana gener i bakterier

A

1: Klyv det humana DNA:t samt bakterieplasmiden med restriktionsenzym
2: Ligera det humana DNA:t med plasmiden
3: Transformera in den rekombinanta plasmiden i bakterier
4: selektera de bakterier som producerar det humana proteinet (de som har rekombinanta plasmider)

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
4
Q

Vad är syftet med restriktionsenzymer/nukleaser?

A

De klipper ut den DNA-sekvens man vill ha genom att hydrolysera fosfodiesterasbindningar

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
5
Q

Vad är syftet med plasmiden?

A

De är vektorer och fungerar som en värd för DNA-fragmentet man vill klona

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
6
Q

Vad används Elektrofores av DNA till vid kloning?

A

Analys av DNA-fragmenten

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
7
Q

Vad sker vid ligering?

A

DNA-fragmenten klistras ihop

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
8
Q

Vad är en rekombinant plasmid?

A

En plasmid med insatt humant DNA

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
9
Q

Vilka två sorters nukleaser/restriktionsenzym finns?

A

Endonukleaser, exonukleaser

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
10
Q

Var klipper endonukleaser DNA:t?

A

I mitten/inne i DNA:t. De klyver sekvensen i två

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
11
Q

Var klipper exonukleaser DNA:t?

A

De klipper i ändarna av sekvensen. De gör sekvensen kortare.

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
12
Q

Det finns tre typer av endonukleaser, typ 1, 2 och 3. Vilken används för kloning?

A

Typ 2

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
13
Q

Beskriv hur typ 2 endonukleaset vet var det ska klyva DNA:t

A

Det har en specifik igenkänningssekvens där det klyver DNA:t. Sekvensen är ett palindrom, dvs det är symmetriskt fram- och baklänges - exempel:

5’ G A A T T C 3’
3’ C T T A A G 5’

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
14
Q

Ge exempel på några restriktionsenzymer (förkortningarna)

A 
Hae III
Taq I
Hha I
EcoRI
EcoRV
Pst I
How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
15
Q

Vilka två sorters plasmider kan bildas vid ligeringen?

A

Rekombinanta plasmider (human+bakterie) och vanliga plasmider (endast bakterie)

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
16
Q

Vad är en kloningsvektor?

A

En DNA-molekyl som kan användas för att föra in främmande DNA i en cell

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
17
Q

Vilka två DNA-molekyler uppfyller kraven för att kunna användas som kloningsvektorer?

A

Plasmider och viruskromosomer

How well did you know this?
1
Not at all
2
3
4
5
Perfectly
18
Q

Vilka krav finns för kloningsvektorer? 4st

A
  • Måste kunna komma in i värdcellen
  • Måste kunna replikeras inne i cellen för att producera flera kopior av sig själv
  • Polylinker (MCS)
  • Selektionsmarkörer (reportergener)
19
Q

Vilka två sätt kan plasmiden finnas i bakterien efter transformeringen?

A

1: Replikering. Plasmiden finns löst i bakteriecytoplasman
2: Integreration: Plasmiden integreras i bakteriens kromosom. Fördelaktigt då det gör plasmiden mer stabil

20
Q

Hur används polylinker?

A

Den syntetiska polylinkern legeras ihop med en plasmid för att konstruera en användbar kloningsvektor

21
Q

Beskriv polylinker - vilka egenskaper har den?

A
  • Många MCS är bra, men inte mer än ett igenkänningsställe

- 50-100 bp

22
Q

Vad innebär egenskapen multiple cloning sites (MCS)?

A

Att DNA-sekvensen har många sites för restriktionsenzym av olika typer att binda in till

23
Q

Vad för olika selektionsmarkörer finns? (2st)

A

Antibiotikaresistensgener och reportergener

24
Q

Vad är syftet med selektionsmarkörer?

A

Att hitta och isolera de kolonier/celler som tagit upp plasmiden

25
Q

Hur fungerar antibiotikaresistensgener som selektionsmarkörer?

A

Om man ger bakterien resistens mot antibiotika samtidigt med DNA-segmentet man vill klona kan man odla på antibiotikainnehållande medium och döda alla bakterier som inte tagit upp den rekombinanta plasmiden

26
Q

Vad är en reportergen?

A

En DNA-sekvens som kodar för ett protein som lätt kan påvisas

27
Q

Vilka egenskaper bör en reportergen ha

A
  • Koda för protein som lätt kan påvisas
  • Bör ej förekomma naturligt i den organism man ska föra in reportergenen i
  • Kan fungera för sig själv eller kopplas till en annan gen (den man vill studera) så att de uttrycks tillsammans
28
Q

Ge exempel på användningsområden för reportergener

A
  • Man kan kontrollera hur framgångsrikt ett kloningsförsök är
  • Man kan sätta in sekvenser framför reportergenen och undersöka om de fungerar som promotorer (och isf hur starka de är)
  • Man kan undersöka hur effektivt genen translateras eller följa vart genprodukten tar vägen i cellen
29
Q

Ge exempel på proteiner som kodas av reportergener och hur man kan påvisa dem

A

GAL/lacZ (beta-galaktosidas): hydrolyserar färglösa galaktosider till färgade produkter

LUC (Lucideras): oxiderar luciferin varvid fotoner emitteras

GFP (green fluorescent protein): fluorescerar vid UV-bestrålning

CAT (kloramfenikolacetyltransferas): överför acetylgrupper till kloramfenikol - kan ge antibiotikaresistens mot kloramfenikol

30
Q

Hur kan man ligera in främmande DNA i en plasmid och sedan välja ut de plasmider som fått insert?

A

1: plasmid innehållande ampicillin- + tetracillinresistens klyvs vid ampicillin-res-genen (tar bort ampicillinresistensen)
2: Främmande DNA ligeras till plasmiden med DNA-ligas
3: Plasmiden förs in i E. coli som sedan odlas på tetracyklininnehållande agar - selekterar fram de som tagit upp plasmid
4: Överför kolonier till matchande platser på plattor med a) tetracyklin och b) tetracyklin + ampicillin
5: Se vilka kolonier som INTE växt på platta b) - dessa har tagit upp rekombinanta plasmider.

31
Q

Vad är skillnaden mellan transformering och transfektion?

A

Transformering: När en bakterie tar upp DNA från omgivningen (naturlig process). Bakterien måste vara kompetent eller göras kompetent

Transfektion: När man överför DNA till en human/däggdjurscell

32
Q

Hur används lacZ/betagalaktosidas som reportergen? Vilken skillnad kan observeras hos de bakterier som fått insert och inte?

A

Efter transformation odlas bakterierna på agar innehållande X-gal och IPTG.

Insert: växer med vita kolonier

Ingen insert: växer med blå kolonier

33
Q

Hur påverkar pUC-plasmiderna med lacZ-genen E. colis beta-galaktosidasmolekyler? Hur ser de ut i vanliga E. coli?

+++++++

A

Vanliga E. coli har ofullständiga lacZ-gener och producerar därmed ofullständiga betagalaktosidasmolekyler utan normal N-terminal –> ofunktionellt enzym

pUC-plasmider med lacZ-genen kodar för en liten del av betagalaktosidasets N-terminal, och ger därför upphov till små betagalaktosidasfragment (alfa-peptider) som gör betagalaktosidasmolekylerna hela –> ger funktionellt enzym

34
Q

Vad är X-gal och hur fungerar det?

+++++

A

Det är en galaktosanalog som kan användas som substrat av betagalaktosidasenzymet.

35
Q

Hur bestäms bassekvensen av E. coli efter kloning?

A

Lambda-DNA klyvs i många fragment av olika storlek och ligeras i plasmider. Efter transformation renas plasmid fram ur en av kolonierna och klyvs med restriktionsenzym för att separera lambda-DNA:t från plasmiden och det undersöks med gelelektrofores för att se om det fanns ett insert och isf hur stort det var.

Sekvensering visar vilken del av lambda-DNA:t som satt i plasmiden

36
Q

Vilka steg ingår i klyvning av DNA med restriktionsenzym? (5 steg)

A
  1. Börja med 1 mikrogram (ug) DNA i 23ug vatten
  2. Tillsätt vatten och RE till en totalvolym av 50ul
  3. Inkubera i 37 grader 1-2h
  4. Upphetta till 65 (alt 80) grader i 10-15 min
  5. Ta ut ett prov för att kontrollera att klyvningen fungerat
37
Q

Hur går gelelektrofores till?

A

Ett DNA-prov laddas i brunnar på gel (vid minuspolen) ofta innehållande etidiumbrotid, ström appliceras och fragmenten börjar färdas mot pluspolen

38
Q

Vad separerar DNA-elektrofores fragmenten baserat på?

A

Storlek eller konformation (cirkulär/linjär)

39
Q

Hur påverkar geltätheten separationen av DNA-fragmenten?

A

Tätare gel separerar mindre fragment då större fragment har svårt att ta sig igenom gelen och fastnar vid brunnen.

40
Q

Vad används etidiumbrotid till?

A

Visualisering av DNA:t. Det binder i DNA:t mellan basparen (intercalering). Vid belysning med UV-ljus lyser DNA:t med gul färg.

OBS: cancerframkallande

41
Q

Vilket ämne kan användas istället för etidiumbrotid och hur farligt är det?

A

GelStar, ofarligt

42
Q

Hur påverkas mängden fragment av tillsatsen av olika RE?

A

Det blir olika mängd fragment beroende på antal igenkänningsställen som RE har.

43
Q

Hur vandrar de olika konformationerna av plasmid-DNA i gelen?

A

Mer relaxerade former av DNA:t (cirkulärt) vandrar långsammare än de supercoilade formerna.

BMA043 Molekylärbiologisk metodik (7 decks)

Brainscape helps you reach your goals faster, through stronger study habits.
© 2024 Bold Learning Solutions. Terms and Conditions