Cours 1 - Structure et spécificité des protéases à sérine Flashcards
(150 cards)
1
Q
Quelles sont les principales caractéristiques d’une enzyme ?
A
Une enzyme est un catalyseur biologique, généralement une protéine (parfois un ARN, appelé ribozyme).
- Elle n’est pas détruite ni altérée lors de la réaction.
- Sa fonction peut dépendre de cofacteurs (ions organiques, molécules organiques ou métallo-organiques).
- Son activité repose sur son intégrité structurelle.
2
Q
Quel est l’objectif principal de l’étude de la cinétique enzymatique ?
A
Étudier :
- Mécanisme moléculaire
- Sélectivité des enzymes
- Établir le lien entre la structure de l’enzyme et ses propriétés fonctionnelles.
3
Q
Que signifie le terme “hydrolases” en enzymologie ?
A
Les hydrolases sont des enzymes qui catalysent la coupure d’une liaison chimique par l’ajout d’une molécule d’eau (H₂O).
4
Q
Quelle est la fonction des protéases et quels sont leurs types ?
A
Les protéases catalysent le clivage des liaisons amides dans les protéines. Il en existe trois types principaux :
- Protéases à sérine
- Protéases à cystéine
- Métallo-protéases
5
Q
Quelle est la fonction des ribonucléases ?
A
Les ribonucléases catalysent le clivage des liaisons entre l’ARN et l’ADN. Elles peuvent être des ribonucléases protéiques ou des ribozymes.
6
Q
Qu’est-ce que l’activité GTPase des protéines G ?
A
C’est une activité enzymatique qui permet l’hydrolyse du GTP en GDP, jouant un rôle clé dans la signalisation cellulaire et la régulation des protéines G.
7
Q
Pourquoi les protéases sont-elles des enzymes très étudiées ?
A
- Premiers catalyseurs biologiques à avoir été purifiés et caractérisés.
- Rôle essentiel dans de nombreux processus biologiques > Clivage peptidique.
8
Q
Quelles sont les principales fonctions des protéases ?
A
- Digestion des protéines alimentaires
- Clivage de précurseurs hormonaux pour activer certaines hormones
- Clivage de précurseurs viraux, comme dans le cas du VIH ou du SARS-CoV-2
- Coagulation du sang, jouant un rôle clé dans l’hémostase
- Dégradation des protéines cellulaires, contribuant au renouvellement et à la régulation des protéines intracellulaires
9
Q
Quelle réaction chimique est catalysée par toutes les protéases ?
A
Toutes les protéases catalysent l’hydrolyse du lien peptidique, permettant ainsi la coupure des protéines en fragments plus petits.
10
Q
Quelles sont les deux composantes obtenues après l’hydrolyse d’un lien peptidique ?
A
- Une composante carboxyle (-COO⁻)
- Une composante amine (-NH₃⁺)
11
Q
Pourquoi certaines protéases possèdent-elles une activité estérase ?
A
Certaines protéases catalysent également l’hydrolyse des liaisons ester.
- Cette activité estérase a été cruciale pour élucider le mécanisme de la chymotrypsine, une enzyme impliquée dans la digestion des protéines.
12
Q
Quelle est la différence entre l’hydrolyse d’un lien peptidique et l’hydrolyse d’un lien ester ?
A
- L’hydrolyse d’un lien peptidique produit un carboxyle et une amine.
- L’hydrolyse d’un lien ester produit un acide carboxylique et un alcool.
13
Q
Quelle est la différence entre une endopeptidase et une exopeptidase ?
A
- Endopeptidase: coupe les liaisons peptidiques internes d’une protéine, entraînant une hydrolyse limitée.
- Exopeptidase: coupe les liaisons peptidiques aux extrémités (N- ou C-terminal), ce qui peut mener à la dégradation complète de la protéine.
14
Q
Quel est l’effet d’une hydrolyse limitée par une endopeptidase ?
A
L’hydrolyse limitée permet de fragmenter la protéine sans la dégrader entièrement.
15
Q
Quel type de protéase est responsable de la dégradation complète d’une protéine ?
A
Les exopeptidases sont responsables de la dégradation complète des protéines, car elles clivent les liaisons aux extrémités N- ou C-terminales.
16
Q
Où les aminopeptidases et carboxypeptidases exercent-elles leur action ?
A
- Les aminopeptidases coupent les liaisons au niveau de l’extrémité N-terminale.
- Les carboxypeptidases coupent les liaisons au niveau de l’extrémité C-
terminale.
17
Q
Sur quels critères les protéases sont-elles classées ?
A
Les protéases sont classées en fonction de leur site actif, de leur mécanisme d’action et de leur structure tertiaire.
18
Q
Quelles sont les six classes principales de protéases selon leur mécanisme catalytique ?
A
- Protéases à sérine
- Protéases à thréonine
- Protéases à cystéine
- Protéases à acides aspartiques
- Métalloprotéases
- Protéases à acides glutamiques
19
Q
Quelles sont les principales familles de protéases à sérine ?
A
- Sérine I : Trypsine, Chymotrypsine, Élastase
- Sérine II : Subtilisine
20
Q
Quelles sont les principales familles de métalloprotéases ?
A
- Métallo I : Carboxypeptidase A
- Métallo II : Thermolysine
21
Q
Explique c’est quoi un site catalytique?
A
Le site catalytique (ou site actif) est la région de l’enzyme qui contient les groupements catalytiques impliqués directement dans la réaction chimique.
22
Q
Explique c’est quoi un site de spécificité ?
A
Le site de spécificité (ou site de reconnaissance/de liaison) est la région de l’enzyme qui interagit avec le substrat, permettant la reconnaissance et l’ancrage du substrat à l’enzyme.
23
Q
Comment est organisé le site de liaison d’un substrat polypeptidique sur une enzyme ?
A
Le site de liaison d’un substrat polypeptidique est divisé en sous-sites, qui sont des régions de l’enzyme interagissant avec des acides aminés spécifiques du substrat.
24
Q
Comment sont nommés les acides aminés et sous-sites dans la nomenclature enzymatique ? (5)
A
- Les acides aminés du substrat sont notés P (pour peptide).
- Les sous-sites enzymatiques sont notés S.
- Les acides aminés du côté amine du lien hydrolysé sont numérotés P’1, P’2, P’3….
- Les acides aminés du côté carboxyle du lien hydrolysé sont numérotés P1, P2, P3….
- Les sous-sites correspondants sur l’enzyme sont notés S1, S2, S3… et S’1, S’2, S’3….
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Pourquoi un sous-site enzymatique ne correspond-il pas forcément à une séquence continue d’acides aminés ?
Un sous-site enzymatique peut être formé de résidus non adjacents, car l’enzyme adopte une structure tridimensionnelle (3D) qui permet aux résidus éloignés dans la séquence primaire de se retrouver proches dans la structure finale.
26
Quels types de liaisons la chymotrypsine peut-elle hydrolyser ?
La chymotrypsine, une protéase de type sérine I, catalyse l’hydrolyse des liens amide (dans les protéines) et des liens ester.
27
Quels acides aminés sont préférentiellement clivés par la chymotrypsine ?
- Tyrosine (Tyr)
- Tryptophane (Trp)
- Phénylalanine (Phe)
- Méthionine (Met)
28
Quelle est la caractéristique commune des acides aminés ciblés par la chymotrypsine ?
Ces acides aminés possèdent de grands groupes latéraux aromatiques, ce qui leur permet d’interagir avec les sous-sites hydrophobes de l’enzyme.
29
Quel substrat a été utilisé pour étudier le mécanisme de la chymotrypsine ?
L’acétate de para-nitrophényle (PNPA) a été utilisé comme substrat ester pour étudier le mécanisme de la chymotrypsine.
30
Quels sont les produits de l’hydrolyse du PNPA par la chymotrypsine ?
- L’ion p-nitrophénolate
- L’ion acétate
31
Quel est le rôle de l’activité estérase dans l’étude du mécanisme de la chymotrypsine ?
L’activité estérase de la chymotrypsine a permis d’élucider son mécanisme catalytique,
- En particulier la formation d’un intermédiaire acyl-enzyme, similaire au mécanisme de l’hydrolyse des liaisons peptidiques.
32
Quelle est la cinétique observée lors de l’hydrolyse du PNPA par la chymotrypsine ?
- Une phase rapide (pré-stationnaire) où le p-nitrophénolate est libéré immédiatement.
- Une phase stationnaire, où la formation de l’ion acétate devient plus lente.
33
Pourquoi observe-t-on une phase rapide suivie d’une phase plus lente ?
Ce comportement cinétique est compatible avec la formation rapide d’un intermédiaire acyl-enzyme, suivie d’une étape plus lente où l’enzyme se régénère après l’hydrolyse complète.
34
Quelles sont les trois étapes du mécanisme de l’acyl-enzyme dans la catalyse par la chymotrypsine ?
1) Addition : L’enzyme (via la S195) attaque le substrat, libérant rapidement le premier produit et formant un intermédiaire acyl-enzyme (phase rapide).
2) Formation de l’intermédiaire acyl-enzyme : L’enzyme reste liée au substrat sous forme d’un intermédiaire stable.
3) Hydrolyse de l’intermédiaire acyl-enzyme : L’eau intervient pour libérer le deuxième produit, ce qui est une phase plus lente, correspondant à la vitesse limitante.
35
Pourquoi observe-t-on une phase rapide suivie d’une phase lente ?
Parce que la première réaction devrait se finir avant que la deuxième réaction avec l'enzyme pourrait commencer.
36
Quelle est la vitesse limitante de la réaction catalysée par la chymotrypsine ?
La vitesse limitante est l’hydrolyse de l’intermédiaire acyl-enzyme, qui se fait plus lentement que la formation de cet intermédiaire.
37
Que représente l’extrapolation au temps zéro dans l’étude de l’hydrolyse du p-nitrophénylacétate (PNPA) ?
L’extrapolation au temps zéro permet de déterminer la concentration initiale d’enzyme active, en utilisant la phase rapide pré-stationnaire avant d’atteindre l’état stationnaire.
38
Pourquoi utilise-t-on un substrat en excès par rapport à l’enzyme dans une étude cinétique ?
L’utilisation d’un substrat en excès garantit que la vitesse initiale de réaction dépend uniquement de la concentration en enzyme active, permettant ainsi de mieux analyser la cinétique enzymatique.
39
Quelle est l’utilité de l’extrapolation au temps zéro dans l’étude de l’acyl-enzyme ?
L’extrapolation au temps zéro permet de déterminer la concentration initiale d’enzyme active,
- En utilisant les courbes de l’état stationnaire pour estimer la quantité d’enzyme fonctionnelle.
40
Explique la réaction qui implique la chymotrypsine et le p-nitrophényléthylcarbonate?
Permet la formation d'un intermédiaire acyl-enzyme (E-O-COOEt). Cet intermédiaire est produit rapidement, mais son hydrolyse est lente.
41
Quelles sont les deux explications possibles pour le rapport de 0,63 mol de p-nitrophénolate produit par mole d’enzyme ?
1) L’enzyme active est pure à 63 %, donc toutes les molécules enzymatiques ne sont pas fonctionnelles.
2) La constante de formation de l’acyl-enzyme n’est pas beaucoup plus grande que la constante de déacylation, empêchant l’accumulation significative de l’intermédiaire.
42
Qu’est-ce que 𝑘𝑐𝑎𝑡 et que représente-t-il en enzymologie ?
Vitesse de renouvellement ("turnover number"), est le nombre de molécules de substrat transformées en produit par unité de temps et par site actif lorsque l’enzyme est saturée par le substrat.
43
Quelle est la signification de la constante de Michaelis-Menten 𝐾𝑀?
- KM est la concentration en substrat pour laquelle la vitesse initiale de réaction
𝑣0 est égale à la moitié de la vitesse maximale 𝑉𝑚𝑎𝑥.
- Elle représente l’affinité apparente de l’enzyme pour son substrat : plus 𝐾𝑀 est faible, plus l’enzyme a une forte affinité pour le substrat.
44
Que représente le rapport
𝑘𝑐𝑎𝑡/𝐾𝑀 et pourquoi est-il important ?
Constante de spécificité. Il mesure l’efficacité catalytique de l’enzyme dans des conditions où la concentration en substrat est faible (𝑆≪𝐾𝑀 ).
- Plus ce ratio est élevé, plus l’enzyme est efficace pour transformer son substrat en produit.
45
Comment est défini 𝑘𝑐𝑎𝑡 dans ce mécanisme à trois étapes ?
k cat = k2*k3 / k2+k3
Il dépend donc des vitesses d'acylation (k2) et de déacylation (k3), ce qui reflète la cinétique en deux phrases.
46
Comment est modifiée la constante de Michaelis-Menten 𝐾𝑀 dans ce modèle
de mécanisme à trois étapes?
KM = (k-1/k1) * (k3/k2+k3)
47
Quel est l’impact du rapport entre 𝑘2 (acylation) plus grand que 𝑘3 (déacylation) sur la cinétique enzymatique ?
Si 𝑘2 ≫ 𝑘3: La formation de l’intermédiaire acyl-enzyme est rapide, mais la libération du deuxième produit (P2) est plus lente. Cela entraîne une cinétique biphasique typique d’un mécanisme en trois étapes.
48
Quel est l’impact du rapport entre 𝑘2 (acylation) plus petit que 𝑘3 (déacylation) sur la cinétique enzymatique ?
Si 𝑘2 ≪ 𝑘3: L’étape limitante devient la formation de l’intermédiaire acyl-enzyme, ce qui modifie la cinétique enzymatique et ralentit la réaction.
49
Quelle est la différence entre l’hydrolyse d’une liaison ester et d’une liaison amide par la chymotrypsine ?
- Hydrolyse d’une liaison ester (ex. PNPA) : Formation rapide de l’intermédiaire acyl-enzyme, suivi d’une libération plus lente du produit P2.
- Hydrolyse d’une liaison amide : La formation de l’intermédiaire acyl-enzyme devient l’étape limitante, ce qui ralentit encore plus la réaction.
50
Quel résidu est impliqué dans la catalyse de la chymotrypsine et comment a-t-il été identifié ?
Le résidu sérine 195 a été identifié comme étant essentiel pour la catalyse.
- Cette découverte a été faite en isolant une enzyme acétylée stable à faible pH, où le groupe acétyle était spécifiquement lié à Ser195.
51
Quel inhibiteur a permis d’identifier Ser195 comme résidu catalytique ?
Le (DFP) a permis d’identifier Ser195, car seule cette sérine parmi les 27 présentes dans la chymotrypsine réagit avec le DFP, formant une liaison covalente stable.
52
Quel est le mode d’action du DFP sur les protéases à sérine ?
Le DFP inactive irréversiblement les protéases à sérine en formant une liaison covalente au site actif (attaque nucléophile sur Ser195).
- C’est un inhibiteur de type "suicide", ce qui signifie que l’enzyme est définitivement inactivée après la liaison.
53
Pourquoi le DFP est-il un inhibiteur mortel ?
Empêchant ainsi la dégradation de l’acétylcholine, un neurotransmetteur. Son accumulation excessive aux jonctions nerveuses et neuromusculaires entraîne une paralysie et peut provoquer l’asphyxie.
54
À quelle famille chimique appartient le DFP et quelles sont ses applications ?
Le DFP fait partie des composés organophosphorés, utilisés principalement comme insecticides en raison de leur capacité à inhiber l’acétylcholinestérase.
55
Quel est le lien entre le gaz sarin et le DFP ?
Comme le DFP, le gaz sarin est un inhibiteur irréversible et mortel de l’acétylcholinestérase. Il provoque une paralysie fatale.
56
Quel est le rôle du PMSF en enzymologie ?
(PMSF) est un inhibiteur spécifique des protéases à sérine. Il bloque de façon irréversible l’activité enzymatique en se liant au site actif de la sérine.
57
Quels sont les inconvénients du PMSF ? (2)
- Non soluble dans l’eau, ce qui limite son utilisation.
- Toxique (neurotoxine), représentant un danger pour la manipulation en laboratoire.
58
Quelle alternative au PMSF est utilisée et pourquoi ?
L’AEBSF est une meilleure alternative car il est aussi un inhibiteur irréversible des protéases à sérine,
- Mais avec une meilleure solubilité en solution aqueuse et une toxicité réduite par rapport au PMSF.
59
Quel est l’effet du TPCK sur la chymotrypsine ?
(TPCK) inhibe irréversiblement la chymotrypsine en formant une liaison covalente avec l’histidine 57 (His57) du site actif.
60
Pourquoi le TPCK est-il un inhibiteur spécifique de la chymotrypsine ?
Le TPCK possède un groupe aromatique qui s’ajuste au site de spécificité de la chymotrypsine, ce qui lui permet de cibler sélectivement cette enzyme.
61
Quel type d’inhibition est provoqué par le TPCK ?
Il s’agit d’une inhibition compétitive irréversible, où le TPCK se lie de façon covalente au site actif et empêche définitivement l’enzyme de fonctionner.
62
Quel résidu catalytique est ciblé par le TPCK et quel est son rôle ?
Le résidu His57 est ciblé par le TPCK. Ce résidu joue un rôle essentiel dans la catalyse enzymatique, en facilitant le transfert de protons lors de la formation et l’hydrolyse de l’intermédiaire acyl-enzyme.
63
Qu’est-ce que la triade catalytique de la chymotrypsine ?
La triade catalytique est composée de trois acides aminés essentiels au mécanisme de la chymotrypsine :
- His57 : Joue le rôle de base et acide général (accepteur et donneur de proton).
- Ser195 : Responsable de l’attaque nucléophile sur le substrat.
- Asp102 : Stabilise His57, en le maintenant dans la bonne position pour la catalyse.
64
Quel est le rôle de l’His57 dans la catalyse enzymatique ?
L’His57 agit comme une base générale, acceptant un proton de la Ser195, ce qui active son attaque nucléophile sur le substrat.
65
Pourquoi Asp102 est-il essentiel à l’efficacité de la chymotrypsine ?
L’Asp102 stabilise le bon tautomère de l’His57 et le maintient dans la bonne orientation, optimisant ainsi la catalyse.
66
Qu’est-ce qu’une Low-Barrier Hydrogen Bond (LBHB) ?
Une LBHB (Low-Barrier Hydrogen Bond) est une liaison hydrogène particulièrement forte.
67
Quelle est la preuve expérimentale de l’existence d’une LBHB dans la chymotrypsine ?
Un signal RMN du ¹H à très bas champ (18,3 ppm) a été observé dans des solutions acides de la chymotrypsine, indiquant une interaction particulière entre Asp102 et His57, compatible avec une LBHB.
68
Comment les composés peptidyl trifluorométhyl ketones (TFK) permettent-ils d’étudier la LBHB ?
- Les TFK sont des inhibiteurs réversibles qui forment une liaison covalente transitoire avec Ser195.
- En imitant l’état de transition enzymatique, ils permettent de détecter un signal RMN caractéristique d’une LBHB, confirmant son rôle dans la catalyse.
69
Quel est le rôle des LBHB dans la catalyse enzymatique ?
Les LBHB stabilisent l’état de transition de la réaction enzymatique et abaissent l’énergie d’activation en augmentant la basicité de His57.
- Cela rend His57 un meilleur accepteur de proton, facilitant la déprotonation de Ser195 et accélérant la catalyse.
70
Quel était l’objectif de la mutagenèse dirigée de Asp102 ?
L’objectif était de vérifier l’importance de Asp102 dans la catalyse en le remplaçant par un résidu isostérique non chargé : l’Asparagine (Asn).
71
Quel effet a eu la mutation Asp102Asn sur la catalyse enzymatique ?
- Le 𝑘𝑐𝑎𝑡 a été diminué d’un facteur 5000, montrant que Asp102 est important mais pas absolument nécessaire pour la catalyse.
- La réaction avec le DFP est ralentie 10 000 fois, indiquant que Ser195 devient un moins bon nucléophile.
72
Pourquoi Asp102 joue un rôle clé dans la catalyse enzymatique ?
Asp102 stabilise la triade catalytique et augmente le caractère nucléophile de Ser195, facilitant son attaque sur le substrat.
73
Quelles sont les conclusions tirées de la mutation Asp102Asn ?
- Asp102 n’est pas indispensable, mais il joue un rôle essentiel dans l’efficacité de la catalyse.
- Son absence réduit drastiquement la réactivité de Ser195, ce qui affecte la vitesse de réaction de l’enzyme.
74
Comment se décompose le mécanisme de clivage du lien peptidique par la chymotrypsine ?
Le mécanisme est divisé en deux grandes phases :
- L’acylation (étapes 1-3) : Formation de l’intermédiaire acyl-enzyme.
- La désacylation (étapes 4-7) : Libération du produit clivé et récupération de l’enzyme sous sa forme active.
75
Comment le substrat se positionne-t-il dans le site actif de la chymotrypsine ? (étape 1)
Le substrat adopte une orientation favorable à la réaction. La chaîne latérale de la phénylalanine du substrat se place dans une cavité hydrophobe, qui est le principal site de spécificité de l’enzyme.
76
Quel est le rôle de la cavité hydrophobe dans le site actif de la chymotrypsine ? (étape 1)
La cavité hydrophobe permet de stabiliser les chaînes latérales hydrophobes des acides aminés spécifiques (comme la phénylalanine, la tyrosine ou le tryptophane) pour favoriser le bon positionnement du substrat dans le site actif.
77
Pourquoi l’orientation du substrat est-elle essentielle pour la catalyse ? (étape 1)
L’orientation correcte du substrat permet :
- Un alignement précis avec les résidus catalytiques (Ser195, His57 et Asp102).
- Une optimisation de l’interaction avec la cavité oxyanionique et la cavité hydrophobe.
- Une stabilisation de l’état de transition, favorisant ainsi l’acylation.
78
Quel rôle joue la cavité oxyanionique dans la réaction enzymatique ? (étape 1)
La cavité oxyanionique stabilise les charges négatives de l’oxygène carbonyle du substrat lors de la formation des intermédiaires tétraédriques, ce qui facilite la catalyse.
79
Quelle est l’étape clé de l’attaque nucléophile de la Ser195 sur le carbonyle du substrat ? (étape 2)
L’attaque nucléophile de la Ser195 sur le carbonyle du substrat s’accompagne d’un transfert de proton de la Ser195 à l’His57, dans un mécanisme de catalyse basique.
80
Quel est le premier intermédiaire formé après l’attaque de la Ser195 ? (étape 2)
L’attaque de la Ser195 produit un intermédiaire tétraédrique, où l’atome d’oxygène du carbonyle porte une charge négative.
81
Comment cet intermédiaire est-il stabilisé dans le site actif de l’enzyme ? (étape 2)
L’intermédiaire tétraédrique est stabilisé par des ponts hydrogène dans la cavité oxyanionique de l’enzyme.
82
Pourquoi l’intermédiaire tétraédrique ne s’accumule-t-il pas ? (étape 2)
L’intermédiaire tétraédrique a une durée de vie très courte et est rapidement converti en l’étape suivante du mécanisme enzymatique.
83
Quelle est la conséquence de la rupture du lien peptidique du substrat ? (étape 3)
La rupture du lien peptidique du substrat entraîne la libération d’un produit amine.
84
Quel est le rôle de l’His57 dans cette étape #3 ?
L’His57 joue un rôle dans la catalyse acide en transférant un proton au produit amine, facilitant ainsi sa libération.
85
Quel est le nouvel intermédiaire formé après la libération du produit amine ? (étape 3)
L’intermédiaire formé est l’acyl-enzyme, qui résulte de la liaison covalente entre l’enzyme et le fragment acylé du substrat.
86
Pourquoi l’intermédiaire acyl-enzyme peut-il s’accumuler durant la réaction ? (étape 3)
L’intermédiaire acyl-enzyme peut s’accumuler si l’étape suivante, la déacylation, est plus lente, ce qui limite la progression rapide de la réaction enzymatique.
87
Quelle est l’étape clé de la déacylation présentée sur étape #4 ?
L’étape clé est la liaison d’une molécule d’eau à l’intermédiaire acyl-enzyme, un prérequis pour la prochaine étape d’hydrolyse.
88
Quel est le rôle de la molécule d’eau dans cette étape de la déacylation ? (étape 5)
La molécule d’eau attaque le carbone carbonyle de l’intermédiaire acyl-enzyme, formant un intermédiaire tétraédrique transitoire.
89
Quel est le rôle de l’His57 dans cette étape #5?
L’His57 agit comme une base catalytique, facilitant l’attaque nucléophile de l’eau en acceptant un proton.
90
Pourquoi l’intermédiaire formé est-il de courte durée ? Quelle est la conséquence de cette étape sur l’état de l’enzyme ? (étape 5)
L’intermédiaire tétraédrique est instable et se réarrange rapidement pour libérer l’enzyme et compléter l’hydrolyse.
- Cette étape permet la régénération de l’enzyme, la préparant pour une nouvelle réaction catalytique.
91
Quelle est la transformation qui se produit lors de cette étape #6?
L’intermédiaire tétraédrique est converti en produit final grâce à la catalyse acide de l’His57.
92
Quel est le rôle de l’His57 dans cette étape #6 ?
L’His57 transfère un proton à Ser195, facilitant la rupture de la liaison enzyme-substrat et la libération du produit.
93
Quelle est la conséquence de cette étape #6 sur l’enzyme ?
Cette conversion régénère l’enzyme, lui permettant d’être réutilisée pour une nouvelle réaction.
94
Pourquoi cette étape #6 est-elle essentielle dans la catalyse enzymatique ?
Elle permet la fin de la réaction enzymatique, assurant la libération du produit et le retour de l’enzyme à son état actif.
95
Quel est le produit final libéré lors de l'étape #6 ? Quelle est la conséquence de cette libération sur l’enzyme ? Pourquoi cette étape est-elle essentielle dans le cycle enzymatique ?
- Le second produit, un carboxylate, est libéré.
- L’enzyme est régénérée, retrouvant son état libre et actif.
- Elle termine le cycle catalytique et permet à l’enzyme de reprendre une nouvelle réaction.
96
Quelles sont les deux formes possibles de l’enzyme dans le mécanisme ping-pong ?
L’enzyme peut exister sous deux formes :
- E, la forme libre et non modifiée
- E*, une forme chimiquement modifiée (acyl-enzyme)
97
Comment se déroule la libération des produits dans ce mécanisme ?
1) Le substrat A (ex : PNPA) se fixe sur l’enzyme, modifie l’enzyme en E* par transfert d’un groupe chimique (ex : groupe acétyl).
2) Le premier produit P (ex : ion paranitrophénolate) est libéré.
3) Le substrat B (ex : une molécule d’eau) se fixe sur E*, réagit avec lui et libère le deuxième produit Q (ex : ion acétate).
4) L’enzyme revient à son état initial (E) et peut recommencer un nouveau cycle.
98
Qu’est-ce qu’un zymogène ?
Un zymogène (ou proenzyme) est un précurseur protéique inactif d'une enzyme. Il nécessite un clivage protéolytique pour être activé à un moment et/ou un endroit précis.
99
Pourquoi les enzymes sont-elles synthétisées sous forme de zymogènes ?
Cela permet d’éviter une activation prématurée et de réguler les processus cellulaires en activant l’enzyme uniquement au bon moment et au bon endroit.
100
Quels sont les principaux exemples de zymogènes et leurs fonctions ?
1. La digestion : Les enzymes digestives sont produites sous forme inactive pour éviter d’endommager les tissus avant d’arriver à leur site d’action.
2. La coagulation du sang : La coagulation repose sur une cascade d’activation protéolytique où plusieurs protéases sous forme de zymogènes s’activent successivement.
3. La réponse hormonale : Certaines hormones (ex. proinsuline) sont d’abord produites sous une forme inactive avant leur activation.
4. L’apoptose : La mort cellulaire programmée est contrôlée par des procaspases inactives, qui sont activées par clivage.
101
Quel est le rôle de l’entéropeptidase dans la digestion ?
L’entéropeptidase est une enzyme présente dans la muqueuse du duodénum qui active la trypsine en clivant son précurseur inactif, le trypsinogène.
102
Pourquoi la libération des enzymes digestives doit-elle être strictement régulée ?
Cela permet d’éviter l’activation prématurée des enzymes dans le pancréas, ce qui pourrait causer des dommages aux tissus pancréatiques et conduire à une pancréatite aiguë.
103
Quelle est la forme inactive de la chymotrypsine ?
La chymotrypsine est synthétisée sous forme de zymogène inactif, appelé chymotrypsinogène.
104
Comment la chymotrypsine devient-elle active ?
Le chymotrypsinogène est activé par clivage protéolytique par la trypsine, qui produit une forme intermédiaire π-chymotrypsine, capable d’autocatalyse pour former la forme active α-chymotrypsine.
105
Quelle est la différence entre la π-chymotrypsine et l’α-chymotrypsine ?
- La π-chymotrypsine est n'est pas active pour l’autocatalyse, mais n’est pas encore complètement mature.
- L’α-chymotrypsine est la forme finale active, capable de catalyser efficacement la réaction enzymatique.
106
Quelles enzymes sont comparées dans cette analyse des protéases à sérine de type I ?
Les enzymes comparées sont :
- Chymotrypsinogène
- Trypsinogène
- Élastase
107
Quelle est l’importance des ponts disulfures dans ces enzymes ?
- Plusieurs ponts disulfures sont présents (indiqués en jaune).
- Certains de ces ponts sont conservés entre les enzymes, ce qui contribue à la stabilité de leur structure.
108
Quelle est la caractéristique principale de la structure tridimensionnelle des protéases de la famille S1 ?
La structure tridimensionnelle des protéases de la famille S1 est commune et possède deux domaines avec le site actif situé entre ces deux domaines.
- Chaque domaine est formé d’un tonneau β constitué de brins β antiparallèles.
- Les deux tonneaux β sont orientés à angle droit.
109
Quels éléments différencient les structures des différentes protéases de la famille S1 ?
Bien que les structures tertiaires de la trypsine, de l’élastase et de la chymotrypsine soient très similaires, les principales différences se situent au niveau des régions exposées et des boucles externes.
110
Pourquoi le chymotrypsinogène est-il inactif ?
Le site actif du chymotrypsinogène est caché par un inhibiteur interne qui bloque l’accès du substrat, empêchant ainsi l’activité catalytique.
111
Quel est l’effet de cette interaction électrostatique sur la structure de la chymotrypsine ?
Elle entraîne des changements de conformation, permettant au site actif d’interagir avec le substrat et assurant le bon positionnement de la poche de l’oxyanion.
112
Quel est le rôle de l’églin C dans l’inhibition de la chymotrypsine ?
L’églin C est un inhibiteur naturel de protéase de type canonique, qui forme un complexe stable avec la chymotrypsine et bloque son site actif.
113
Pourquoi l’inhibition par l’églin C est-elle réversible ?
L’églin C est un inhibiteur compétitif réversible qui forme un complexe non-covalent, permettant à l’inhibiteur de se dissocier et de libérer l’enzyme active.
114
Dans quel état structurel se trouve l’enzyme en présence de l’églin C ?
La chymotrypsine est bloquée dans un état E-S pré-catalytique, empêchant ainsi la libération des produits et la poursuite de la réaction enzymatique.
115
Quelle est la différence entre un inhibiteur protéique et un inhibiteur non-protéique ?
- Un inhibiteur protéique provient des protéines d'organismes du même type ou d'organismes apparentés.
- Un inhibiteur non-protéique provient des micro-organismes.
116
Qu'est-ce que la poche de l'oxyanion ?
La poche de l'oxyanion (ou cavité oxyanonique) est une structure formée par les groupes amides de Ser195 et Gly193, qui permet de stabiliser l'oxyanion des états de transition tétraédriques au cours de la réaction enzymatique.
117
Quel rôle joue la poche de l'oxyanion dans la catalyse enzymatique ?
Elle stabilise les états de transition tétraédriques formés pendant la réaction, en formant des liaisons hydrogène avec l’oxyanion.
118
Quelle est la différence entre l'évolution convergente et l'évolution divergente des protéases à sérine ?
- Évolution convergente : Des protéines non apparentées développent un même mécanisme (ex. : subtilisine et chymotrypsine avec une triade catalytique similaire).
- Évolution divergente : Une protéine ancestrale évolue en plusieurs enzymes (ex. : chymotrypsine, trypsine, élastase) conservant le mécanisme mais différant en spécificité.
119
Pourquoi la subtilisine et la chymotrypsine sont-elles un exemple d'évolution convergente ?
Bien que ces enzymes aient des séquences et structures différentes, elles ont évolué indépendamment pour acquérir une triade catalytique semblable et un même mécanisme de catalyse.
120
Qu'est-ce que la spécificité enzymatique ?
La spécificité enzymatique est la capacité d'une enzyme à hydrolyser certains substrats de préférence à d’autres, en fonction de la nature des acides aminés présents en position P₁ du substrat.
121
Quelle est la différence de spécificité entre la chymotrypsine, la trypsine et l’élastase ?
- Chymotrypsine : hydrolyse préférentiellement les acides aminés aromatiques (Phe, Tyr, Trp).
- Trypsine : hydrolyse préférentiellement les acides aminés chargés positivement (Lys, Arg).
- Élastase : hydrolyse préférentiellement les petits acides aminés (Gly, Ala).
122
Pourquoi peut-on considérer que ces enzymes travaillent en équipe ?
Ces trois enzymes permettent de décomposer une chaîne peptidique en hydrolysant des liaisons spécifiques, chacune reconnaissant un type précis de résidu en P₁. Ainsi, elles se complètent dans la dégradation des protéines.
123
Quelle est la principale différence structurale expliquant la spécificité de chaque enzyme ?
- Chymotrypsine : Poche large et hydrophobe, idéale pour les acides aminés aromatiques (Phe, Tyr, Trp).
- Trypsine : Présence d’un résidu Asp189 chargé négativement, permettant de fixer les acides aminés chargés positivement (Lys, Arg).
- Élastase : Poche plus étroite due à la présence de Thr et Val, empêchant l’accès des grands résidus et favorisant les petits acides aminés (Gly, Ala).
124
Pourquoi le rapport
𝑘𝑐𝑎𝑡/𝐾𝑀 est-il un paramètre clé pour caractériser la spécificité enzymatique ?
Le paramètre qui quantifie l’efficacité catalytique globale d’une enzyme pour un substrat donné. Il prend en compte :
- 𝑘𝑐𝑎𝑡 (turnover number) : la vitesse maximale de conversion du substrat en produit.
- 𝐾𝑀 (constante de Michaelis) : la concentration du substrat à laquelle l’enzyme atteint la moitié de sa vitesse maximale.
125
Que signifie le fait que
𝑘𝑐𝑎𝑡/𝐾𝑀 soit similaire pour deux substrats différents ?
- Un substrat peut avoir un 𝐾𝑀 plus faible (meilleure affinité) mais un 𝑘𝑐𝑎𝑡 plus faible.
- Un autre peut avoir un 𝐾𝑀 plus élevé (moins bonne affinité) mais un 𝑘𝑐𝑎𝑡 plus grand.
- Dans ce cas, ces deux effets se compensent, et les deux substrats sont hydrolysés à vitesse équivalente.
126
Comment fonctionne le substrat marqué au MCA ?
Le MCA (7-amino-4-méthylcoumarine) est un marqueur fluorescent qui est quiescent lorsqu’il est lié à un peptide.
- Lorsqu’il est hydrolysé par une protéase, il est libéré et devient fluorescent, permettant ainsi de mesurer directement l’activité enzymatique par spectroscopie UV.
127
Quelle est la différence entre MCA et PNA comme marqueurs de substrats ?
- MCA : génère un signal de fluorescence lorsqu’il est libéré.
- PNA (paranitroanilide) : prend une couleur jaune une fois libéré, détectable par spectroscopie UV-visible.
- Les deux méthodes permettent de suivre l’hydrolyse du substrat en temps réel, mais MCA est plus sensible grâce à sa fluorescence.
128
Qu’est-ce que la fluorescence réduite (quenched) ?
La fluorescence réduite est un phénomène où l’énergie d’excitation d’un donneur de fluorescence est transférée à un accepteur, réduisant ainsi l’émission de fluorescence.
- Ce transfert d'énergie se produit par résonance et dépend de la distance entre le donneur et l'accepteur.
129
Comment la fluorescence est-elle augmentée lors de l’hydrolyse du substrat ?
Lors du clivage de la liaison peptidique, le donneur et l’accepteur sont séparés, empêchant le transfert d’énergie et permettant ainsi au donneur d’émettre de la fluorescence.
- L’intensité de cette fluorescence est proportionnelle à la quantité de peptide hydrolysé.
130
Pourquoi ce type de substrat est-il utile pour l’étude des protéases ?
Ces substrats permettent de quantifier l’activité enzymatique des protéases en mesurant l’augmentation de la fluorescence, qui est directement liée à l’hydrolyse du peptide.
131
Qu’est-ce que la mutagenèse dirigée ?
La mutagenèse dirigée est l’induction volontaire d’une ou plusieurs mutations dans un site précis d’un gène recombinant afin de produire une protéine mutante.
132
Quels sont les objectifs de la mutagenèse dirigée en enzymologie ?
- Mieux comprendre le mode d’action des enzymes.
- Illustrer le lien entre la détermination des paramètres cinétiques (k_cat, K_M, k_cat/K_M) et leur interprétation au niveau atomique.
- Modifier les propriétés structurelles et/ou fonctionnelles des enzymes pour des études sur la relation structure-fonction.
133
Quelle est la relation entre l’énergie libre de Gibbs de liaison (ΔGₛ) et la constante de dissociation (Kₛ) ?
ΔGS=−RTlnKS
Cela signifie que plus Kₛ est faible (interaction enzyme-substrat forte), plus ΔGₛ est négatif, indiquant une liaison plus stable et une dissociation moins favorable.
134
Qu’implique une valeur faible de Kₛ sur l’interaction enzyme-substrat ?
Un Kₛ plus faible signifie une interaction enzyme-substrat plus forte et donc une liaison plus stable.
- Cela correspond à un ΔGₛ plus négatif, indiquant une plus grande différence d’énergie entre l’état libre (E + S) et l’état lié (ES), ce qui rend la dissociation du substrat moins favorable.
135
Quelles sont les variables impliquées dans l’équation de Van’t Hoff ?
- ΔGₛ : Énergie libre standard de liaison.
- R : Constante universelle des gaz.
- T : Température absolue (Kelvin).
- Kₛ : Constante de dissociation enzyme-substrat.
136
Qu’est-ce que la barrière d’énergie libre de la réaction (ΔG‡) et quel est son effet sur la vitesse de réaction ?
- Plus ΔG‡ est élevé, plus la réaction est lente, car il est plus difficile d’atteindre l’état de transition.
- Plus ΔG‡ est faible, plus la réaction est rapide, car l’état de transition est plus accessible.
137
Quel est l’effet d’une valeur faible de k_cat/K_M sur la formation de l’état de transition (ES‡) ?
- Un k_cat/K_M faible indique que la réaction est plus lente, ce qui signifie que ΔG‡ est plus élevé.
- Cela rend la formation de ES‡ moins favorable, réduisant ainsi l’efficacité catalytique de l’enzyme.
138
Quelle est l’utilité du paramètre 𝑘𝑐𝑎𝑡/ 𝐾𝑀 dans l’évaluation des interactions enzymatiques ?
1) Évaluer la contribution d’une interaction à la stabilité de l’état de transition, en étudiant l’effet des résidus de la triade catalytique et de la poche de l’oxyanion.
2) Évaluer la contribution d’une interaction à la spécificité de l’enzyme, en analysant les résidus de la poche de spécificité.
139
Quelle est l'importance des liaisons hydrogène dans la subtilisine ?
Les ponts hydrogène stabilisent l’intermédiaire tétraédrique de l’état de transition, facilitant ainsi l’efficacité catalytique de la subtilisine.
140
Que signifie une diminution de k_cat/K_M ?
Une forte diminution de k_cat/K_M indique une instabilité accrue de l’état de transition, rendant la catalyse enzymatique moins efficace.
141
Pourquoi la mutation Asn155 → Thr155 entraîne-t-elle une diminution de l’efficacité catalytique ?
- Asn155 est impliqué dans la formation de ponts hydrogène qui stabilisent l’état de transition.
- En le mutant en Thr155, cette stabilisation est perturbée, rendant la réaction moins efficace.
142
Quelle est l’équation reliant l’énergie d’activation Δ𝐺‡ à l’état de transition ?
- ΔG0‡ est l’énergie libre standard d’activation chimique, liée aux ruptures et formations de liaisons.
- Δ𝐺𝑙 correspond à l’énergie de liaison dans l’état de transition.
143
Que permet de mesurer une mutation d’un résidu impliqué dans la réaction chimique ?
Elle permet d’évaluer la contribution de ce résidu à l’énergie d’activation chimique.
- On compare alors 𝑘𝑐𝑎𝑡/𝐾𝑀 avant et après mutation.
144
Si le résidu muté n’est pas directement impliqué dans la réaction chimique, quel paramètre peut-on considérer comme constant ?
On peut considérer Δ𝐺0‡ (énergie d’activation chimique) comme constant.
145
Quelle est la mutation effectuée pour modifier la spécificité de la trypsine ? Quel est l’objectif de cette mutation ?
La mutation Asp189 → Ser189 au niveau du site de spécificité de la trypsine.
- Le but est de convertir la spécificité en P1 de la trypsine en celle de la chymotrypsine, en modifiant la reconnaissance des substrats.
146
Quel est l'effet du mutant Ser189 sur la spécificité enzymatique ?
Il est moins actif avec les substrats typiques de la trypsine (Arg & Lys) et plus actif avec ceux de la chymotrypsine (Tyr et autres).
147
Quel est l'effet de la mutation Asp189 → Lys189 sur la spécificité de la trypsine ?
→ Cette mutation modifie la préférence de la trypsine pour ses substrats, en la faisant passer d'une affinité pour les résidus chargés positivement (comme la lysine) à une affinité pour les résidus chargés négativement (comme l'aspartate).
148
Quel est l'effet de la mutation Asp189 → Lys189 sur l'activité de la trypsine envers les substrats Lys et Arg ?
→ L’enzyme mutante Lys189 devient inactive sur les substrats contenant des résidus lysine (Lys) ou arginine (Arg), alors que la trypsine normale les hydrolyse efficacement.
149
Quelle particularité l’enzyme Lys189 acquiert-elle en termes de reconnaissance des substrats ?
→ En plus d’hydrolyser des substrats contenant des résidus phénylalanine (Phe) et tyrosine (Tyr), l’enzyme Lys189 acquiert une nouvelle spécificité lui permettant de cliver les liaisons impliquant la leucine (Leu).
150
Comment la cavité hydrophobe résultante pourrait-elle influencer la spécificité de l’enzyme mutante ?
→ La cavité hydrophobe modifie l’environnement du site actif, ce qui peut favoriser la reconnaissance et la liaison de substrats contenant des résidus hydrophobes comme la tyrosine (Tyr), modifiant ainsi la spécificité enzymatique.
