Cours 3 - Nucléases

Question 1

Qu’est-ce qu’une nucléase et quel est son rôle principal ?

Answer 1

→ Une nucléase est une enzyme qui hydrolyse les liens phosphodiesters des acides nucléiques.

Question 2

Quels sont les types de biocatalyseurs qui peuvent agir comme nucléases ?

Answer 2

• Les enzymes protéiques
• Les ribozymes (enzymes constituées d’ARN)
• Les DNAzymes (enzymes constituées d’ADN)

Question 3

Quelles sont les principales fonctions cellulaires des nucléases ?

Answer 3

→ Elles sont impliquées dans les mécanismes génétiques de base,

→ Le contrôle de l’expression des gènes,

→ La signalisation extracellulaire,

→ La défense de l’hôte et la mort cellulaire.

Question 4

Quels sont les rôles les plus importants des nucléases?

Answer 4

→ Réparation ADN
→ Réparation ARN
→ Traduction
→ Réponse immunitaire innée contre les bactéries et les virus
→ Mort cellulaire (ex. caspases)

Question 5

Quelles sont les conséquences des mutations dans les nucléases ?

Answer 5

→ Elles sont associées à plusieurs maladies humaines, notamment des troubles génétiques, inflammatoires et neurologiques.

Question 6

Qu’est-ce que le Syndrome Dicer1 et quel gène est impliqué ?

Answer 6

→ C’est un désordre génétique causé par des mutations du gène codant pour la ribonucléase Dicer, augmentant le risque de tumeurs dans plusieurs organes (poumons, reins, ovaires, thyroïde, etc.).

Question 7

Vrai ou Faux : La DNase 1 est impliquée dans le Syndrome Dicer1.

Answer 7

→ Faux, elle est impliquée dans le lupus érythémateux systémique.

Question 8

Quel est le rôle probable des DNAse dans le lupus érythémateux systémique ?

Answer 8

→ Elles pourraient jouer un rôle dans la fragmentation de l’ADN durant l’apoptose.

Question 9

Quelle enzyme est impliquée dans le Syndrome d’Aicardi-Goutières et quel est son rôle ?

Answer 9

→ La RNase H2, qui est impliquée dans le catabolisme intracellulaire des acides nucléiques (dégradation des acides nucléiques).

Question 10

Quels complexes enzymatiques sont affectés dans le syndrome d’Aicardi-Goutières ?

Answer 10

→ L’exonucléase TREX1 et le complexe RNase H2 (RNASEH2A, 2B et 2C).

Question 11

Pourquoi les nucléases sont-elles essentielles au développement de technologies basées sur l’ADN et l’ARN ? (4)

Answer 11

→ 1) Elles permettent la construction,

→ 2) L’identification,

→ 3) l’édition

→ 4) l’analyse des gènes.

Question 12

Quels sont les deux rôles des nucléases dans la construction et l’identification des gènes ?

Answer 12

→ 1) Construction d’ADN recombinant pour le clonage.

→ 2) Cartographie des gènes sur les chromosomes, utilisée pour le séquençage du génome et en médecine légale.

Question 13

Vrai ou Faux : Les nucléases ne jouent aucun rôle dans la thérapie génique.

Answer 13

→ Faux, elles permettent l’édition des gènes, par exemple avec CRISPR/Cas9.

Question 14

Comment les nucléases peuvent-elles être utilisées pour le diagnostic et le traitement du cancer ?

Answer 14

→ Elles servent de cibles moléculaires pour le développement de nouveaux outils diagnostiques et de nouveaux médicaments.

Question 15

Quels sont les avantages des nucléases comme outils analytiques ?

Answer 15

→ Elles peuvent être utilisées pour détecter des polluants environnementaux,

→ Analyser la structure secondaire des ARN et exprimer des ARN dans divers contextes.

Question 16

Vrai ou Faux : Les nucléases peuvent être spécifiques aux riboses ou non.

Answer 16

Vrai.

→Nucléases ribose-spécifiques

→Nucléases non ribose-spécifiques

Question 17

Quelle est la différence entre une exoribonucléase et une endoribonucléase ?

Answer 17

→ Les exoribonucléases dégradent l’ARN à partir des extrémités, tandis que les endoribonucléases coupent à l’intérieur de la chaîne.

Question 18

Quel est un exemple d’endoribonucléase mentionné dans la diapositive ?

Answer 18

→ La ribonucléase A.

Question 19

Quels types de produits sont générés par l’action des exoribonucléases et des endoribonucléases ?

Answer 19

→ Des mononucléotides 3’-phosphate ou 5’-phosphate.

Question 20

Quels sont les deux types principaux de désoxyribonucléases générales ?

Answer 20

→Exodésoxyribonucléases

→Endodésoxyribonucléases.

Question 21

Donne un exemple d’exodésoxyribonucléase.

Answer 21

→ 3’, 5’-exonucléase DNAse I.

Question 22

Quels sont les types d’enzymes de restriction et à quoi servent-elles ?

Answer 22

→ Type I et Type II ; elles coupent l’ADN à des sites spécifiques.

Question 23

Quels sont les deux types de nucléases non ribose-spécifiques ?

Answer 23

→ Exonucléases et endonucléases.

Question 24

Vrai ou Faux : Les nucléases non ribose-spécifiques ne produisent que des mononucléotides 3’-phosphate.

Answer 24

→ Faux, elles peuvent produire des mononucléotides 3’-phosphate ou 5’-phosphate.

Question 25

Quel est le rôle de la ribonucléase A ?

Answer 25

→ Elle est une endoribonucléase qui dégrade spécifiquement les ARN simple brins avec un résidu C ou U en 5’ du lien clivé.

Question 26

Pourquoi dit-on que le mécanisme de la ribonucléase A est en deux étapes ?

Answer 26

→ Parce que la dégradation de l’ARN suit une première étape de transestérification et une seconde étape d’hydrolyse.

Question 27

Que se passe-t-il lors de la première étape du mécanisme enzymatique de la ribonucléase A ?

Answer 27

→ Il y a une transestérification, qui convertit le lien 3',5'-phosphodiester en un lien 2',3'-phosphodiester, provoquant la coupure de la chaîne d’ARN.

Question 28

Quel est le produit intermédiaire formé après la première étape dans le mécanisme de la Ribonucléase A ?

Answer 28

→ Un 2',3'-phosphate cyclique.

Question 29

Que se passe-t-il lors de la deuxième étape dans le mécanisme de la Ribonucléase A ?

Answer 29

→ Le phosphate cyclique 2'-3' est hydrolysé pour produire un groupe 3'-monophosphate.

Question 30

Quels types de résidus en 5’ du lien clivé sont préférentiellement reconnus par la ribonucléase A ?

Answer 30

→ Les résidus cytosine (C) et uracile (U).

Question 31

Vrai ou Faux : La ribonucléase A coupe spécifiquement les brins d’ARN double brin.

Answer 31

→ Faux, elle cible les ARN simple brins.

Question 32

Quel type de réaction chimique est impliqué dans l’action de la ribonucléase A ?

Answer 32

→ Une hydrolyse du lien phosphodiester.

Question 33

Quelle est la géométrie adoptée par l’état de transition dans la première étape du mécanisme de la ribonucléase A ?

Answer 33

→ Une géométrie trigonale bipyramidale.

Question 34

Pourquoi l’état de transition adopte-t-il une géométrie trigonale bipyramidale ?

Answer 34

→ Pour positionner les atomes d’oxygène en 2’ et 5’ en ligne avec le phosphore, facilitant ainsi la réaction enzymatique.

Question 35

Quel composé est un analogue de l’état de transition de la ribonucléase A ?

Answer 35

→ Le vanadate.

Question 36

Pourquoi le vanadate est-il utilisé comme analogue de l’état de transition ?

Answer 36

→ Il imite la structure chimique de l’état de transition, facilitant son étude. Plus stable

Question 37

Quelle technique a été utilisée pour étudier la structure de la ribonucléase A en complexe avec l’uridine vanadate ?

Answer 37

→ La résonance magnétique nucléaire (RMN).

Question 38

Quels acides aminés interagissent avec l’uridine vanadate dans la ribonucléase A ? (5)

Answer 38

→ Phe120, Thr45, Asp83, Ser123, Val43.

Question 39

Quel réseau stabilise l’interaction entre la ribonucléase A et son substrat ?

Answer 39

→ Un réseau de liaisons hydrogène.

Question 40

Quel type de mécanisme catalytique est utilisé par la ribonucléase A ?

Answer 40

→ Un mécanisme acide-base général.

Question 41

Quelles sont les deux résidus impliqués dans le mécanisme catalytique de la ribonucléase A ? Quel est le rôle?

Answer 41

→ Deux histidines ayant des pKa proches de la neutralité. → Elles participent à l’activation et la stabilisation du substrat en jouant un rôle d’acide et de base.

Question 42

Pourquoi la lysine 41 est-elle importante pour l’activité enzymatique ?

Answer 42

→ Elle stabilise l’état de transition via une interaction électrostatique et un pont hydrogène fort.

Question 43

Vrai ou Faux : L’His-12 agit toujours comme acide et l’His-119 comme base.

Answer 43

→ Faux, leurs rôles s’inversent entre les deux étapes.

Question 44

Quel organisme sert de modèle pour le mécanisme de la phosphatase alcaline ?

Answer 44

→ Escherichia coli (E. coli).

Question 45

Quelles réactions enzymatiques la phosphatase alcaline peut-elle catalyser ?

Answer 45

→ L’hydrolyse de l’ADN et de l’ARN, produisant des extrémités 5’-phosphate et 3’-OH.

Question 46

Pourquoi la phosphatase alcaline est-elle qualifiée de "monoestérase non spécifique" ?

Answer 46

→ Parce qu’elle peut enlever les 5’-phosphates de divers substrats, notamment l’ADN, l’ARN, les dNTPs et les rNTPs.

Question 47

Quels types de résidus protéiques peuvent être déphosphorylés par la phosphatase alcaline ?

Answer 47

→ Les résidus sérine (Ser), thréonine (Thr) et tyrosine (Tyr).

Question 48

Pourquoi la présence de cations divalents est-elle importante pour la phosphatase alcaline ?

Answer 48

→ Parce qu’ils sont nécessaires pour l’activité enzymatique et la stabilisation du site actif.

Question 49

Quelle est la différence principale entre le mécanisme à deux cations et le mécanisme à trois cations de la phosphatase alcaline ?

Answer 49

→ Le mécanisme à trois cations inclut un ion magnésium (Mg²⁺) en plus des deux ions zinc (Zn²⁺), jouant un rôle dans l’ionisation de la sérine 102.

Question 50

Quel est le rôle de l’ion magnésium dans ce mécanisme à trois cations de la phosphatase alcaline ?

Answer 50

→ Il stabilise alternativement un groupe OH⁻ ou une molécule d’eau, influençant l’ionisation de la sérine 102 pour en faire un meilleur nucléophile.

Question 51

Pourquoi l’ionisation de la sérine 102 est-elle importante dans le mécanisme à trois cations de la phosphatase alcaline?

Answer 51

→ Elle permet à la sérine 102 d’agir plus efficacement comme nucléophile en attaquant le phosphate du substrat.

Question 52

Quels ions sont impliqués dans la stabilisation du site actif de l’enzyme dans le mécanisme à trois cations de la phosphatase alcaline?

Answer 52

→ Deux ions Zn²⁺ et un ion Mg²⁺.

Question 53

Quels rôles peuvent jouer les cations divalents dans les mécanismes enzymatiques ?

Answer 53

→ Ils peuvent stabiliser la charge négative du nucléophile, →Stabiliser un groupement hydroxyle, →Stabiliser la géométrie de l’état de transition et rendre le groupe partant plus efficace.

Question 54

Quel cation intervient dans la stabilisation du nucléophile en première étape ? (Mécanisme à Trois Cations de la Phosphatase Alcaline)

Answer 54

→ Zinc 2 (Zn²⁺), qui interagit avec la sérine 102 pour faciliter son attaque nucléophile.

Question 55

Quel cation stabilise l’hydroxyde utilisé comme nucléophile en deuxième étape ? (Mécanisme à Trois Cations de la Phosphatase Alcaline)

Answer 55

→ Zinc 1 (Zn²⁺), qui maintient l’ion OH⁻ en position pour attaquer le phosphore.

Question 56

Quel est le rôle du magnésium (Mg²⁺) dans ces nucléases ?

Answer 56

→ Il stabilise tantôt un groupement OH⁻, tantôt une molécule d’eau, influençant ainsi l’ionisation de la sérine 102.

Question 57

Quels cations sont impliqués dans la stabilisation de l’état de transition ?

Answer 57

→ Zinc 1 (Zn²⁺) et Zinc 2 (Zn²⁺), qui interagissent directement avec le phosphate.

Question 58

Pourquoi la stabilisation de l’état de transition est-elle cruciale ?

Answer 58

→ Parce qu’elle diminue l’énergie d’activation et facilite la progression de la réaction.

Question 59

Pourquoi dit-on que les cations jouent plusieurs rôles dans ces nucléases ?

Answer 59

→ Parce qu’ils ne se contentent pas de stabiliser une seule espèce chimique, mais participent à plusieurs étapes clés du mécanisme.

Question 60

Qu’est-ce qu’un ribozyme ?

Answer 60

→ C’est une molécule d’ARN qui possède une activité enzymatique et peut catalyser des réactions de transfert de phosphate et d’hydrolyse.

Question 61

Quels sont les cinq ribozymes naturels les mieux caractérisés ?

Answer 61

→ - Le ribozyme des introns du groupe I → - Le ribozyme "hairpin" → - Le ribozyme à tête de marteau ("hammerhead") → - Le ribozyme du virus de l’hépatite delta → - La RNAse P

Question 62

Quelle est la différence entre un exon et un intron ?

Answer 62

→ Les exons sont des séquences exprimées d’un gène, tandis que les introns sont des séquences réprimées qui doivent être retirées avant la traduction.

Question 63

Quel est le rôle des introns du groupe I dans la maturation des ARN ?

Answer 63

→ Ils subissent une réaction d’auto-épissage, c'est-à-dire qu’ils se retirent eux-mêmes sans l’aide de protéines.

Question 64

Que signifie "auto-épissage" ?

Answer 64

→ Cela signifie que l’intron est capable de se retirer sans intervention d’enzymes ou de complexes protéiques.

Question 65

Où trouve-t-on les introns du groupe I ?

Answer 65

→ Dans certains pré-ARNm nucléaires d’eucaryotes, des ARN d’organites (comme les mitochondries et les chloroplastes) et quelques ARN bactériens.

Question 66

Combien d’étapes comprend l’auto-épissage des introns du groupe I ? Quelle molécule initie la réaction d’auto-épissage ?

Answer 66

→ Trois étapes. → La guanosine.

Question 67

Quel est le rôle du groupe 3'-OH de la guanosine dans la première étape ?

Answer 67

→ Il attaque le phosphate en 5' de l’intron, formant une liaison phosphodiester et libérant l’exon en 5'.

Question 68

Que se passe-t-il lors de la deuxième étape de l’auto-épissage ?

Answer 68

→ Le nouveau groupe 3'-OH de l’exon en 5' attaque le phosphate en 3' de l’intron, provoquant l’épissage des deux exons et la libération de l’intron.

Question 69

Pourquoi le ribozyme des introns du groupe I n’est-il pas considéré comme un véritable enzyme ?

Answer 69

→ Parce qu’il ne se régénère pas après la réaction, contrairement aux enzymes classiques.

Question 70

Vrai ou Faux : L’auto-épissage des introns du groupe I nécessite l’intervention d’une protéine.

Answer 70

→ Faux, il est entièrement catalysé par l’ARN lui-même.

Question 71

Pourquoi les ribozymes clivant en trans sont-ils considérés comme de véritables enzymes ?

Answer 71

→ Parce qu’ils ne sont pas détruits durant la réaction et peuvent être réutilisés, contrairement aux ribozymes qui réalisent une réaction d’auto-épissage.

Question 72

Quel est le rôle de la guanosine ou de l’eau dans la coupure en trans ?

Answer 72

→ Elles agissent comme nucléophiles pour attaquer la liaison phosphodiester.

Question 73

Comment le ribozyme reconnaît-il son substrat ?

Answer 73

→ Par formation de paires de bases Watson-Crick et de paires G-U, qui sont essentielles au site de clivage.

Question 74

Pourquoi peut-on modifier la spécificité du ribozyme ?

Answer 74

→ Parce que sa séquence peut être ajustée pour reconnaître différentes séquences d’acides nucléiques.

Question 75

Quel est le site de clivage principal dans le ribozyme des introns du groupe I ?

Answer 75

→ Il est localisé dans la région P1, où se trouve la liaison phosphodiester ciblée.

Question 76

Quelle est l’application principale des ribozymes modifiés en termes de biotechnologie ?

Answer 76

→ Ils peuvent être utilisés comme enzymes de restriction spécifiques à l’ARN.

Question 77

Pourquoi la structure tertiaire est-elle importante pour l’activité du ribozyme ?

Answer 77

→ Parce que, tout comme chez les protéines, la structure tridimensionnelle est essentielle à sa fonction catalytique.

Question 78

Quel type de cations est impliqué dans la catalyse du ribozyme des introns du groupe I ?

Answer 78

→ Des cations divalents, notamment le magnésium (Mg²⁺).

Question 79

Quels sont les deux mécanismes généraux proposés pour la coupure des liaisons phosphodiesters ?

Answer 79

→ 1) Une attaque nucléophile intramoléculaire par un hydroxyle 2'-OH adjacent au phosphate clivé. → 2) Une attaque nucléophile intermoléculaire par un hydroxyle ou un autre oxyanion.

Question 80

Quelle est la différence entre une attaque nucléophile intramoléculaire et intermoléculaire ?

Answer 80

→ L’attaque intramoléculaire provient d’un groupe dans la même molécule (ex. 2'-OH de l’ARN), → Tandis que l’attaque intermoléculaire implique une molécule externe (ex. OH⁻ en solution).

Question 81

Pourquoi l’attaque nucléophile est-elle essentielle dans ces mécanismes ?

Answer 81

→ Parce qu’elle initie la coupure de la liaison phosphodiester en formant un intermédiaire de réaction.

Question 82

Quels types de cations sont généralement impliqués dans ces enzymes ?

Answer 82

→ Des cations divalents comme le Mg²⁺ et le Zn²⁺.

Question 83

Quels groupes fonctionnels des protéines participent directement au mécanisme de la réaction ?

Answer 83

→ Les histidines qui jouent le rôle d’acide ou de base.

Question 84

Quels acides aminés stabilisent les charges négatives formées durant la réaction ?

Answer 84

→ L’arginine (ARG) et la lysine (LYS).

Question 85

Pourquoi les acides nucléiques sont-ils désavantagés par rapport aux protéines pour la catalyse enzymatique ?

Answer 85

→ Parce qu’ils n’ont pas de résidus avec un pKa proche du pH physiologique comme l’histidine et n’ont pas de résidus chargés positivement à pH 7,0 comme l’arginine (ARG) et la lysine (LYS).

Question 86

Quels types de résidus dans les protéines facilitent la catalyse enzymatique ?

Answer 86

→ Des résidus comme l’histidine, l’arginine et la lysine qui participent à la stabilisation des charges et aux transferts de protons.

Question 87

Comment les ribozymes peuvent-ils compenser l’absence de résidus basiques chargés positivement ?

Answer 87

→ En utilisant des bases ayant un pKa modifié, ce qui leur permet d’agir comme donneurs ou accepteurs de protons dans la catalyse.

Question 88

Pourquoi la modification du pKa des bases est-elle importante dans la catalyse par les ribozymes ?

Answer 88

→ Parce qu’elle leur permet d’adopter des propriétés catalytiques proches de celles des résidus enzymatiques des protéines.

Question 89

Quel type de mécanisme catalytique est proposé pour le ribozyme hairpin ?

Answer 89

→ Un mécanisme acide-base général.

Question 90

Quels sont les deux éléments principaux jouant le rôle d'acide et de base dans ce mécanisme (ribozyme hairpin) ?

Answer 90

→ A38 joue le rôle d’acide général, tandis que G8 joue le rôle de base générale.

Question 91

Quel est le nucléophile impliqué dans la réaction de clivage (ribozyme hairpin)?

Answer 91

→ L’oxygène endocyclique du 2'-OH de A-1.

Question 92

Pourquoi A38 est-il considéré comme un acide général dans ce mécanisme (ribozyme hairpin)?

Answer 92

→ Parce qu’il donne un proton au groupement partant, facilitant la coupure de la liaison phosphodiester.

Question 93

Quel est le rôle de G8 dans la catalyse (ribozyme hairpin)?

Answer 93

→ Il extrait un proton du 2'-OH, le rendant plus nucléophile pour attaquer le phosphate.

Question 94

Comment est formé le site actif du ribozyme hairpin ?

Answer 94

→ Par l’association de deux boucles internes, qui positionnent précisément les bases catalytiques.

Question 95

Quel est le but principal de l’étude du ribozyme Hairpin ?

Answer 95

→ Comprendre si les ARN/ribozymes peuvent adopter un mécanisme acide-base général, similaire à celui de l’ARNase I.

Question 96

Quelle est la principale différence entre le ribozyme Hairpin et une enzyme comme l’ARNase I ?

Answer 96

→ L’ARNase I utilise une histidine comme catalyseur acide-base, tandis que le ribozyme Hairpin doit utiliser une nucléobase pour remplir ce rôle.

Question 97

Quel est le principal inconvénient des ribozymes en tant que catalyseurs biologiques ?

Answer 97

→ Leur faible vitesse catalytique par rapport aux enzymes protéiques.

Question 98

Pourquoi les ribozymes sont-ils considérés comme des outils flexibles en biotechnologie ? aka avantage vs. des nucléases protéique?

Answer 98

→ Parce que leur spécificité peut être programmée en modifiant leur séquence d’ARN, leur permettant de cibler des substrats précis.

Question 99

Qu'est-ce que la méthode SELEX et quel est son objectif ?

Answer 99

→ SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) est une technique permettant de sélectionner des séquences d'ARN ou d'ADN ayant une activité enzymatique ou une forte affinité pour une cible spécifique, grâce à une évolution in vitro.

Question 100

Quel est l'intérêt principal de SELEX dans l'étude des ribozymes ?

Answer 100

→ Cette méthode permet de créer des ribozymes et des DNAzymes artificiels, qui peuvent être utilisés pour la catalyse ou comme outils thérapeutiques et biotechnologiques.

Question 101

Qu’est-ce qu’un aptamère ?

Answer 101

→ Un aptamère est une courte séquence d’ARN ou d’ADN qui peut se lier spécifiquement à une molécule cible comme une protéine, un peptide, un ion ou une cellule entière.

Question 102

Quelle méthode est utilisée pour sélectionner des aptamères ?

Answer 102

→ La sélection in vitro (ou SELEX) permet d’identifier des ARN qui se lient à des cibles spécifiques.

Question 103

Quels types de cibles peuvent être reconnus par les aptamères ?

Answer 103

→ Des ions, des petites molécules, des peptides, des protéines, des organelles, des virus et même des cellules entières.

Question 104

Quel est le but de la sélection in vitro (SELEX) dans l’étude des ribozymes ?

Answer 104

→ Elle permet d’isoler de nouveaux ribozymes et de modifier leur fonction pour catalyser différentes réactions.

Question 105

Quels types de réactions peuvent être catalysés par les ribozymes isolés grâce à SELEX ?

Answer 105

→ Ils catalysent des réactions de transfert et l’hydrolyse de liaisons phosphodiesters.

Question 106

Les ribozymes se limitent-ils aux réactions impliquant des phosphates ?

Answer 106

→ Non, la sélection in vitro a montré que les acides nucléiques peuvent aussi catalyser d’autres réactions, comme la formation de liens peptidiques et le transfert de groupes aminoacyles.

Question 107

Quel est l’avenir des ribozymes ?

Answer 107

→ Ils ont un avenir prometteur en tant qu’outils technologiques et diagnostiques.