Cours 11 Flashcards

Question

Comment se déroule la transcription chez les eubactéries, les archea et les eucaryotes, qui les différencient?

Answer 1

Eubactéries : le facteur sigma aide l’ARN polymérase à lier le promoteur. Un élément enhancer est généralement proximal au promoteur de base, et est occupé par un ou quelques activateurs. Archea: Les facteurs généraux (TBP, TFB et TFE) substituent le facteur sigma. Plusieurs enhancers agissent en amont du promoteur pour recruter l’ARN polymérase et les facteurs généraux. Leur transcription ressemble plus à celle des eucaryotes Eucaryotes: Les facteurs généraux augmentent en nombre. Plusieurs activateurs lient des enhancers qui peuvent être éloignés du promoteur de base. Le complexe médiateur aide les activateurs à recruter l’ARN polymérase et les facteurs généraux. Archea: troisième domaine du vivant, organismes unicellulaires sans noyau mais très différents des bactéries et des eucaryotes UAS= upstream activating sequences = enhancers

Answer 2

Les deux brins d’ADN se séparent en avant du site de polymérisation et se réhybrident juste derrière le site de sortie de l’ARN Durant la transcription la pince se referme sur l’ADN matriciel en bleu (haute processivité). La taille de la bulle de transcription (14 ntds) et l’hybride ADN-ARN (9 ntds) demeurent constants Rudder = gouvernail Pendant l’élongation les deux brins d’ADN se séparent en avant du site de polymérisation et se réhybrident juste derrière le site de sortie de l’ARN. Durant la transcription la pince (clamp) se referme sur l’ADN matriciel en bleu, (haute processivité). La taille de la bulle de transcription (14 ntds) et l’hybride ADN-ARN (9 ntds) demeurent constants, Une partie conservée de la pol II nommée le gouvernail, sépare l’hybride ARN-ADN ADN est hybridé en aval de la bulle de transcription ainsi qu'en amont là où l'ADN est déjà transcrit Pince piège l'ADN pendant l'élongation dans une "fente" permettant la prossivité de l'ADN pol. Le "mur" crée un angle de 90 degrés de l'ADN --> Le brin matrice est alors bien positionné dans le site actif et peut être lu Les NTPs arrivent au pore pour atteindre le site actif, celui-ci caractérisé par la présence d'un ion Mg2+ La boucle de la pince (gouvernail) sépare l'ADN de l'ARNm et permet à la double hélice d'ADN de se reformer suite au passage de l'ADN pol.

Answer 3

L’ARN mésapparié ressort du site actif à travers le canal par lequel rentrent les ribonucléotides TFIIS stimule l’ARN polymérase à raboter (retrancher) l’ARN La transcription reprend à l’extrémité 3’ de l’ARN tronqué La pol II peut corriger des erreurs d’incorporation. Voici un modèle simplifié de l’ADN et l’ARN pendant la transcription. L’ARN mésapparié ressort du site actif à travers le canal par où rentrent les ribonucléotides. TFIIS stimule l’ARN polymérase à raboter (retrancher) l’ARN. La transcription peut reprendre à l’extrémité 3’ de l’ARN tronqué ARN Pol II peut corriger s'il y a mauvais appariement (recule vers le canal) Facteurs TFIIS stimule l'activité exonucléase dans l'ARN pol. pour enlever les mésappariements

Answer 4

L’octamère d’histones ne se dissocie jamais entièrement de l’ADN transcrit Pendant l’élongation la polymérase transcrit l’ADN qui est encore associé aux nucléosomes. ADN forme plutôt des boucles permettant l'ADN Pol de passer sans enlever les histones

Answer 5

La terminaison est très importante. La terminaison, dans le processus de transcription, est une phase à part, car aussi activement le complexe transcripteur a été activé, aussi activement doit-il être démantelé quand l’élongation est accomplie. Nous allons étudier le processus très simple chez les procaryotes, où il y a 2 types de mécanismes. Dans les deux cas, on vise à déstabiliser l’hybride ADN-ARN qui est dans le site active de l’ARN polymérase afin que l'ARN puisse quitter: 1. Le type le plus simple et aussi le plus fréquent de terminaison se produit au niveau de certaines séquences d’ARN qui après leur transcription rendent le complexe d’élongation instable (boucle en épingle à cheveux = séquence palindromique et série de T, = paires de bases A=U peu stable. Déstabilisation de l'hybride ARN-ADN 2. D’autres formes plus complexes de terminaison mettent en jeu une protéine particulière qui favorise la dislocation du complexe d’élongation (terminaison Rho-dépendante chez E. coli). Rho (hélices) lie des séquences libres de ribosomes dans l'ARNm. Ces séquences sont riches en C, pauvres en G et ne forment pas des structures secondaires. ATP-dépendante

Answer 6

La cellule peut utiliser le lactose comme source d'énergie à l’aide de la β-galactosidase La β-galactosidase convertit le lactose en glucose et galactose. La β-galactosidase convertit le lactose en allolactose (50%) (isomérisation). La β-galactosidase est un enzyme inductible (elle est seulement présente en grande quantité en présence de lactose) Jacob et Monod s’intéressé a l’utilisation du lactose comme source de carbone pour les bactéries. Ils savait que la cellule peut utiliser le lactose comme source d'énergie a l’aide de la β-galactosidase, un enzyme qui converti le lactose en glucose et galactose.

Answer 7

Test de coloration sur agar avec X-gal : mutants incapables de régler la synthèse de β-galactosidase Jacob et Monob ont considéré toutes les possibilités : 1) l’enzyme est toujours présente mais pas active, 2) l’ARN qui code pour l’enzyme est là mais il n’est pas traduit ou 3) l’ARN n’est pas la parce que le gène n’est pas transcrit. Pour arrive au model correct ils avait un test d’activité très simple pour la beta galactosidase. Le X-Gal produit un couleur bleu quand il est hydrolysé par la beta galactosidase. Alors le bactéries qui expriment la beta gal sont bleus en présence de X-gal et le bactéries qui n’est l’expriment pas sont blanches. Ils avaient une collection des mutants de E. coli ou ils pouvaient savoir les conditions qui permettais que la beta galactosidase soit exprimé ou pas. L’analyse de se collection des mutants lui ont permis de découvrir lé mécanisme qui régule la synthèse de la beta-galactosidase. Si bactérie positive pour B-galactosidase : bleue. Si négative : blanche

Answer 8

L’activité du répresseur lac, dont l’expression dépend du gène lacI, est ajusté par l’allolactose, isomère β-(1→6) du lactose. Quand du lactose est disponible comme source de carbone, une partie de ce lactose se transforme en allolactose; la fixation de ce dernier au répresseur lac I induit alors une transformation qui entraîne la dissociation du répresseur de son site de liaison sur l’opérateur. L’inactivation du répresseur permet à l’ARN polymérase de commencer à transcrire l’opéron et d'induire l’expression des gènes Le modèle de Jacob et Monod sur la régulation de l’expression de la beta galactosidase montre en fait que l’enzyme est régulé au niveau de la transcription. Le gène qui code pour la beta galactosidase est désigné z et il fait partie d’un operon connu comme l’oéron lac. En absence de lactose, une protéine lie une séquence dans le promoteur que Jacob et Monod ont nommé opérator. Cette protéine réprime la transcription. Ce répresseur est nommé lac I. Dans ces conditions si les bactéries sont poussées dans une un milieu avec le X-gal les colonies seront blanches parce qu’il n’y as pas beaucoup de beta galactosidase. Importante il y a toujours un petite peu de beta galactosidase, la répression n’est pas 100%. En présence de lactose, la petite quantité de beta galactosidase présente va convertir le lactose en allolactose. L’allolactose lie le répresseur qui perdre son affinité pour l’opérateur. Ceci permettre a l’ARN polymérase de transcrire l’opéron lac ou le gène lac z est présente. Dans ces conditions si les bactéries sont poussées dans une un milieu avec le X-gal les colonies seront bleus. L’universalité du modèle de Jacob et Monod reste sur les proprietés du represseur Quand un bactérie pousse dans un milieu où il y a beaucoup de glucose, pas besoin de la B-galactosidase La présence facteurs dépresseurs va inhiber l’expression d’un gène qu »on a pas besoin En présence de lactose, l’allolactose va désactivé le répresseur de son site de liaison sur l’opérateur

Answer 9

Le répresseur lac se fixe simultanément sur deux sites voisins du promoteur de l’opéron lac (O1 et O2), induisant la formation d’une boucle dans l’ADN. Bien que la fixation du répresseur lac n’empêche pas l’ARN polymérase de s ’attacher au promoteur, elle empêche cette enzyme de démarrer la transcription. Le répresseur de lac est un tétramère. Le represseur lac I c’est en fait une protéine que lie l’ADN de façon spécifique. A différence de l’ARN polymérase qui lie l’squelette sucre-phosphate, Lac I reconnaît la séquence de l’operator en faisant des interactions avec les bases azotées. Le site d’interaction est un palindrome, ça veut dire que la séquence d’ADN est identique lorsqu’elle est lu dans le sens 5’-3’ sur un brin et dans le sens 5’-3’ sur le brin complémentaire. A. noter que les sites palindromiques peuvent être consécutif, ça veut dire un après l’autre ou avoir une séquence séparatrice comme dans l’operateur lac. Il y a un 2e site operateur dans le promoteur lac. Lac I est un tétramère, un dimer lie un operator et l’autre dimer le 2e operator. Quand le tétramère lie les deux sites operators la séquence entre les deux sites de liaison forme une boucle PMID: 3301328. Après lac I, la biologie a changé, la régulation transcriptionnelle est accomplie par les protéines qui lie l’ADN de façon spécifiques. LacI est le fondateur de la famille des protéines derrière la plupart des innovations biologiques pendant l’évolution. Lac I est un répresseur, quand il est lié à l’operateur il empêché l’ARN polymérase de démarrer la transcription. Chez les bactéries il y a aussi des activateurs.

Answer 10

Exemple d’activateur : la protéine régulatrice fixant l’AMPc (CRP) En absence d’AMPc, CRP a une faible affinité pour l’ADN. En présence d’AMPc, CRP se fixe à l’ADN. CRP=CAP (catabolyte activator protein) La liaison de CRP à l’ADN permet d’accélérer l’initiation de la transcription par le complexe de l’ARN polymérase. La glucose inhibe la formation de AMPc. L’operon lac est aussi régulé de façon positif par une protéine qui lie l’ADN de façon spécifique : CRP (cyclic AMP receptor protein). Le complexe CRP-AMPc va se fixer aussi à des séquences d’ADN particulières avoisinant les promoteurs d’environ 30 gènes de ce type: cette fixation permet à l’ARN polymérase de démarrer plus efficacement la transcription. Le glucose inhibe la synthése de l’AMP cyclique chez les bactéries. En absence d’AMPc CRP ne peut pas activer la transcription. La régulation positive et négative sur lac z n’arrive pas de façon indépendante. Les activateurs et répresseurs peuvent agir en combinaison AMPc besoin de CRP pour lier l’ADN La régulation positive et négative sur lac z n’arrive pas de façon indépendante. Les activateurs et répresseurs peuvent agir en combinaison comment nous allons montrer a la prochain diapo

Answer 11

Nous pouvons intégrer maintenant le contrôle négatif et positif de l’operon lac et comprendre la régulation selon les besoins de la bactérie. En présence glucose et lactose, CRP/CAP n’est pas active mais le répresseur non plus. Il y aura des niveaux de transcription faible. En absence de glucose et de lactose la transcription est encore plus faible, presque absente, parce que le répresseur est actif. En absence de glucose et mais en présence de lactose, CRP/CAP est actif et le répresseur est inactif. Nous avons le niveau maximal de transcription.

Answer 12

Les gènes sont transcrits de façon contrôlée et soumis à une régulation en fonction de leurs rôles. A. Les activateurs servent à accélérer la transcription à partir de promoteurs peu puissants (Ex: protéine CRP). B. Les répresseurs peuvent freiner la transcription. Les répresseurs agissent de diverses façons: 1- Une des plus directe est d’empêcher l’ARN polymérase d’atteindre le promoteur; le site de fixation du répresseur est alors tellement proche du promoteur qu’une fois fixé, il ne reste plus assez d’espace pour que l’holoenzyme d’ARN polymérase prenne contact avec le promoteur. 2- Dans d’autres cas, les répresseurs n’empêchent pas l’attachement de l’ARN polymérase mais inhibent des réactions d’initiation, comme l’isomérisation ou encore empêche l’enzyme de quitter le promoteur (Ex: répresseur lac de E. coli). Facteur de transcription (de E. coli) « cyclic AMP receptor protein » (CRP) (voir plus loin) Isomérisation = changement conformationnel du complexe de la polymérase et de l’ADN Chez eucaryotes, la présence de chromatines change le contrôle

Answer 13

d) Les gènes lac sont exprimés tout le temps Mutante = désactivée

Answer 14

d) Les gènes lac sont exprimés tout le temps

Answer 15

Facteurs de transcription Du point de vue structural, les FT possèdent (1) un ou plusieurs domaine(s) de fixation à l'ADN qui se fixent à une séquence spécifique régulatrice de l'ADN et (2) un domaine qui module la transcription. Chez les eucaryotes les facteurs de transcription sont les molécules clés qui contrôlent la plupart de phénomènes biologiques. Comme nous avons vu pour lac I, ces facteurs vont lier l’ADN de façon spécifique et vont avoir deux domaines fonctionnels : 1- le domaine de liaison a l’ADN, 2- le domaine de régulation de la transcription.

Answer 16

FT: protéines qui décide si un gène est exprimer ou pas. En fait même les gènes exprimés de façon basale ont besoin des facteurs de transcription pour son expression a cause de la présence de la chromatine qui cache la région du promoteur a la ARN polymérase et les facteurs généraux. Alors on peut classifier les FT en facteurs constitutives et facteurs régulateurs. Les facteurs régulateurs sont ensuite régulés par le développement ou par des signaux spécifiques: par exemple des hormones pour les récepteurs nucléaires, signaux de stress et des voies de signalisation. La spécificité de facteurs de transcription dépende de leur capacité a lier des séquences définies. 1,052 FTs chez l’homme, seulement 62 vérifiés expérimentalement Ici comme exemple nous regardons p53, un facteur activé par le stress d’un dommage a l’ADN. p53 lie l’ADN dans des séquences palindromiques en forme de tétramère. On peut classifier les FT en facteurs constitutives et facteurs régulateurs.

Answer 17

Éléments de réponse (response elements) : sites de fixation initiale des FT qui recrutent médiateur, les facteur généraux et l’ARN polymérase. Éléments de réponse à p53 : séquence consensus LacI, le membre fondateur de protéines qui lie l’ADN et régulent la transcription lie la séquence de l’opérateur dans l’opéron lac. La terminologie de Jacob et Monod n’as pas subsisté. Les sites de liaison pour les FT eucaryotes ont reçu une panoplie de noms différents depuis leur découvert. Les termes response elements (éléments de réponse) ou TFBS (transcription factor binding site) sont les plus souvent utilisés. Chaque FT lie de façon spécifique une séquence consensus qui constitue son élément de réponse. Après cette liaison, le FT peut recruter les complexes de remodelage de la chromatine, médiateur, les FG et la ARN polymérase. On se demande comment un seul FT peut etre si puissant et réguler plusieurs gènes? Séquence consensus Facteur de transcription peuvent agir souvent comme activateur ou répresseur et agis sur séquences spécifiques. Facteurs généraux de la transcription : Facteurs lié à la polymérase

Answer 18

FT : régulateurs principaux de l’expression des génes Chaque facteur de transcription régule l’expression de milliers de gènes Les éléments de réponse sont situés souvent en amont du promoteur et peuvent agir à distance de plusieurs kilobases (i.e 100 kb). Les facteurs de transcription peuvent aussi réprimer les gènes Les FT sont souvent régulés par modifications post-traductionnelles, liaison de hormones ou par d’autres FT La capacité régulatrice de facteurs de transcription s’explique pour le fait qu’un seule facteur peut réguler l’expression de milliers de gènes qui portent tous l’élément de réponse correspondant. Les éléments de réponse sont situés souvent en amont du promoteur et peuvent agir à distance de plusieurs kilobases (i.e. 100 kb). 1 facteur de transcription régule des milliers de gènes.

Answer 19

Chaque type cellulaire est régulé par un ou une combinaison spécifique des FT Chez les organismes multicellulaires il y a plusieurs types cellulaires avec des fonctions différentes. Leur différentiation a partir de cellules progénitrices dépend de l’action des FT spécifiques a chaque type cellulaire. Par exemple le FT MyoD contrôle le tissue musculaire, GATA1 les cellules rouges et une combinaison de FTs les cellules béta pancréatiques qui produisent l’insuline. MYOD : Fibroblaste devient cellule musculaire GATA1 : Important pour la production de globules rouges, plaquettes, leucocytes Facteurs qui dicte le nombre de cellules souches (embryon, bcp) . Fibroblaste à cellules souches Facteurs clés pour macrophage Facteurs cellules T ….

Answer 20

Les facteurs de transcription avec l’homéodomaine contrôlent l’expression des gènes du développement Les homéodomaines reconnaissent la boîte homéotique Structure tridimensionnelle appelée hélice-tour-hélice (trois hélices alpha séparées par une boucle et un tour) Le développement est aussi organisé par des FT spécifiques. Una famille de FT, connu comme les homéodomaines, contrôle l’organisation de l’embryon et l’identité des plusieurs organes des organismes de la mouche aux humains. Des mutations dans les gènes qui codent pour les facteurs homéodomaines change l’identités des organes comme vous pouvez apprécier ici avec ce mouche qui a des pâtes à l’endroit où il devrait avoir des haltères. L’élément de réponse pour les homéodomaines est connu comme la boite homéotique. Cette séquence est présente dans tous les gènes régulés par ses facteurs. Le domaine qui lie l’ADN dans les FT homéodomaines a une structure tridimensionnelle unique appelé hélice-tour-hélice. Lewis, Nusslein Volhard et Weischaus ont reçut le prix Nobel pour la découverte de ces facteurs.

Answer 21

Les gènes Hox contrôlent le développement des segments du corps le long de l'axe antéro-postérieur. Pendant l'embryogenèse, les protéines de domaine homéodomaine contribuent à l'établissement de motifs spatiaux le long de l'axe corporel. Elles sont souvent impliquées dans la détermination de l'identité des différents segments et structures corporels. Le syndrome des mains-pieds-génitaux (HFGS) est un trouble génétique caractérisé par des anomalies des membres et des malformations urogénitales (génitales et urinaires). Le syndrome est associé à des mutations dans le gène HOXA13, qui fait partie de la famille des gènes Hox. Les gènes Hox jouent un rôle crucial dans le développement embryonnaire en régulant la formation et le modèle des segments corporels le long de l'axe antéro-postérieur. Le gène HOXA13, en particulier, est exprimé dans le développement des membres (mains et pieds) et de la région urogénitale.

Answer 22

Quatre facteurs de transcription (Oct4, Klf4, Myc, Sox2) reprogramment les cellules somatiques en cellules souches Les NIH lancent le premier essai clinique aux États-Unis sur la thérapie par cellules souches dérivées du patient afin de remplacer les cellules mourantes de la rétine. Le pouvoir régulateur de facteurs de transcription est bien illustré par les travaux de Shinya Yamanaka qui a découvert 4 FT capables de convertir n’importe que cellule somatique en cellules souches. Ce découvert offre l’espoir pour développer la médecine régénératrice qui vise à traiter de maladies avec des cellules souches fait à partir des cellules somatiques de la même personne. Peut prendre des cellules de la peau pour faire des cellules couches (comme dans l’embryon) Médecine regénérative : Apprendre comment changer les cellules couches en nerfs, d’organe pour régler des maladie comme le parkinson, le diabète, etc.

Answer 23

Propriétés des amplificateurs : -Plusieurs centaines de bps -Plusieurs éléments de réponse -Lient plusieurs FT -La liaison est coopérative Amplificateur (enhancer) : séquences d’ADN qui augmentent la transcription et peuvent agir à distance du promoteur, soit en amont ou en aval Pour la plupart des gènes plus d’un facteur de transcription est requis pour son expression. Souvent nous pouvons identifier une région d’environ une centaine de ntds qui combinent plusieurs éléments de réponse pour réguler l’expression d’un gène. Cette région est nommée enhancer ou amplificateur . Les enhancers peuvent agir a distance et la liaison des différents facteurs de transcription est souvent coopérative. Ça veut dire que la liaison d’un facteurs augmente l’affinité pour un autre. Pour résumer, une ou plusieurs protéines de type activateur se fixe à une séquence amplificateur du gène. Le médiateur en se fixant à l’activateur de même qu’aux facteurs généraux de transcription et à l’ARN polymérase au niveau du promoteur du gène, transmet un signal activateur de transcription à l’ARN polymérase, entraînant ainsi l’expression génique. Figure 21-9 Vue d’ensemble du fonctionnement d’un amplificateur (modifié). La régulation négative de l’expression génique peut se faire par fixation d’une protéine répresseur à une séquence silenceur du gène. Dans les deux cas, des interactions protéine-protéine induisent la formation d’une boucle de l’ADN entre les séquences régulatrices et le promoteur. Ce schéma simple ne rend pas compte de la complexité des nombreuses voies des activateurs et des répresseurs, qui peuvent impliquer une compétition entre les nombreux facteurs protéiques pour la fixation aux sites. Amplificateur : Endroit de l’ADN ou plusieurs éléments de réponses, souvent très loin de la région promotrice Pour eucaryote : besoin de facteurs de transcription Procaryote : Sigma

Answer 24

Coactivateurs (inclus les complexes de remodelage de la chromatine): aident à enlever l’effet répresseur des histones, modifient les histones Corépresseurs: Opposent l’action de coactivateurs, modifient la chromatine L’activation de la transcription implique: 1- la liaison de FT, 2- le recrutement de coactivateurs et le remodelage de la chromatine 3- le recrutement de médiateur 4- le recrutement de la pol II et les facteurs généraux.

Answer 25

Les histones qui flanquent les enhancers actifs sont souvent marquées par l’histone H3 acétylée à la lysine 27 (H3K27ac) et H3 monométhylée à la lysine 4 (H3K4me1).

Answer 26

c) I et iii

Answer 27

a) Des facteurs de transcription spécifiques à chaque type cellulaire

Answer 28

Les transcrits primaires ne sont pour la plupart libérés du complexe transcripteur que sous forme passive et n’acquièrent leur structure finale et leurs fonctions biologiques qu’après avoir subi de profonds remaniements. 3 types de remaniements : La soustraction de nucléotides aux transcrit primaires d’ARN. L’addition à ces derniers de séquences nucléotidiques non codées par le gène correspondant. La modification covalente de certaines bases. L’ensemble des modifications qui transforment les transcrits primaires d’ARN en molécules matures est appelé maturation de l’ARN. La maturation de l’ARN décrit l’ensemble des modifications qui transforment les transcrits primaires d’ARN en molécules matures

Answer 29

La maturation des précurseurs d’ARNm est un des processus biochimiques par lequel les procaryotes diffèrent des Eucaryotes. Chez les procaryotes, le transcrit primaire d’ARNm est traduit tel quel. En fait sa traduction démarre avant même que la transcription ne s’achève.

Answer 30

Chez les eucaryotes, la transcription et la traduction se passent dans des compartiments cellulaires différents: la transcription dans le noyau, la traduction dans le cytoplasme. Cette partition fait que les précurseurs d’ARNm eucaryotes sont remaniés dans le noyau sans interférer avec le processus de traduction. Les pores nucléaires, de grands complexes protéiques de 120 nanomètres de diamètre qui traversent la membrane du noyau des cellules eucaryotes, sont les portes de sortie des molécules d’ARN messager Chez les eucaryotes, noyau, qui complique beaucoup les chose.

Answer 31

L’extrémité 5’ du transcrit primaire est d’abord remaniée par élimination du groupe phosphate terminale sous l’action d’une phosphohydrolase. Le groupe 5’-diphosphate formé réagit avec une molécule de GTP pour donner une liaison 5’-5’triphosphate; (catalysée par une enzyme appelée guanylyltransférase) et la structure résultante est dite « la coiffe ». La coiffe est ensuite modifiée par méthylation de la nouvelle guanine (méthyltransférases). De plus, les groupes hydroxyle-2’ des deux premiers nucléotides du transcrit primaire original peuvent être aussi méthylés. Maturation commence avant la fin de la transcription, dès que le transcrit commence à émerger de l’ARN polymérase: maturation étroitement liée à la maturation (interaction des protéines impliquées). La plupart des ARNm vont avoir une modification dans la coiffe (extrémité 5’) Liaison 5’-5’ phosphodiester pour la coiffe 7-méthyl G (bizarre, habituellement 5’-3’)

Answer 32

En bloquant l’extrémité 5’ de la molécule d’ARNm, la liaison 5’-5’ triphosphate protège la molécule de l’action des 5’ exonucléases. La coiffe transforme aussi le précurseur d’ARNm en substrat pour d’autres enzymes nucléaires de maturation, comme celles qui effectuent l’excision-épissage. Dans l’ARNm définitif, la coiffe sert à ancrer les ribosomes en vue de la synthèse protéique. Les enzymes qui catalysent la formation de la coiffe sont associées a la queue C-terminale de l’ARN pol II La formation de la coiffe commence de que l’ARN émerge de la pol II Quelques ARNs ont une coiffe avec NAD. Polymérase a une queue C-terminale où les enzymes de modification qui font la coiffe sont déjà présente : L’anélyne transférase, etc etc. Qui modifie la coiffe La coiffe sert à stabiliser l’extrémité 5’ de l’ARN naissant. Coiffe sert à la reconnaissance pour débuter la traduction

Answer 33

Les précurseurs d’ARNm eucaryotes sont aussi modifiés à leur extrémité 3’. Dès que l’ARN polymérase II a transcrit la séquence consensus du signal de polyadénylation (AAUAAA), l’ARN naissant est scindé La coupure se produit d’habitude à une distance d’environ 10 à 20 nucléotides en aval du signal poly A et dépend probablement d’autres séquences ainsi qu’éventuellement de la structure secondaire du précurseur d’ARNm. La nouvelle extrémité 3’ ainsi créée sur la molécule sert d’amorce à l’addition récurrente d’une série d’adénosine, au cours d’une réaction catalysée par la poly(A) polymérase. Cette réaction est ATP dépendante et peut ajouter jusqu’à 250 nucléotides pour constituer un appendice de polyadénylate connu sous le nom de queue de poly-A. Clivage à lieu tandis que l’ARN polymérase est encore en action. La poly(A) polymérase agit sans matrice Extrémité 3’ de l’ARNm (précurseur) : signal de poly-A : AAUAAA va être reconnu par complexe de clivage de poly-A La plupart des ARNm sont poly-A en 3’

Answer 34

En amont : avant En aval : après

Answer 35

Après clivage un éxonucléase (Rat1) 5’-3’ dégrade l’ARN naissante La transcription finisse lorsque Rat1 fait une collision avec l’ARN pol II (modèle du torpédo) Les queues poly-A d’ARNm précurseurs et d’ARN matures s’associent fermement à une protéine de 78 kDa (PABP). La formation de ce complexe ARN-protéine stabilise l’ARNm en le protégeant d’une dégradation partant de l’extrémité 3’. Toutefois, il existe des ARNm eucaryotes dépourvus de queue poly-A. Rat1 (exonucléase) reconnait reconnait le 5’ lorsqu’il n’y a pas de coiffe et clive plus vite que l’ARN Pol., ce qui arrête la transcription PABP et poly-A protège le 3’ des exonucléases

Answer 36

b) Guanine modifié attaché à l’extrémité 5’ de l’ARN transcrit

Answer 37

Structure de gènes eucaryotes: introns et exons Les séquences intercalaires qui sont excisées du transcrit primaire d’ARN, qui donc sont absentes de la molécule d’ARN mature, sont les introns. Les séquences présentent à la fois dans le transcrit primaire d’ARN et dans la molécule d’ARN mature constituent les exons. A différence des gènes procaryotes ou la séquence du gène correspond a la séquence de l’ARNm , les gènes eucaryotes ont une structure discontinue. Les séquences qui correspondent avec l’ARNm sont interrompus pour des séquences non codants, appelés introns. Voici un exemple, pour le gène qui code pour l’ovalbumine, la protéine principale du blanc de l’œuf. Dans l’ADN les séquences qui vont former l’ARNm qui codent pour l’ovalbumine sont représentés en bleu et on les appelle exons. Entre les exons nous avons les introns qui sont de séquences non codants. La transcription donne un transcrit primaire avec la coiffe et la queue poly A et ‘c’est transcrit primaire et remanié pour former l’ARNm mature. Les gènes eucaryotes possède beaucoup d’intrants. L’ARNm est donc très différents de l’ADN, puisqu’elle contient seulement des exons. Il faut donc enlever les introns de manière très précise pour faire l’ARNm. Ce processus s’appelle l’épissage

Answer 38

Ce processus se retrouve principalement chez les eucaryotes. La jonction des introns aux exons porte le nom de site d'épissage, car ce sont les endroits où le précurseur d'ARNm sera ouvert par incision, puis refermé Les site d’épissage sont de séquences consensus qui se trouvent aux extrémités 5’ et 3’ des introns. Le précurseur de l’ARNm sera ouvert par incision a la jonction exon-5-intron puis l’exon 5’ est attaché l’exon 3'. Le processus qui élimine les introns et mettre ensemble les exons s’appelle épissage. Regardons les signaux importants pour le processus d’épissage d’un exon en amont ou en 5’ et en exon en aval ou en 3’. Nous avons le site d’épissage en 5’, qui est placé a l’extrémité 5’ de l’intron. De façon équivalent nous avons le site d’épissage 3’ qui est placé entre l’extrémité 3’ de l’intron en amont et l’extrémité 5’ de l’exon en aval. Une troisième signal important qui est placé entre 20 et 50 ntds du site d’épissage 3’ c’est la boite de branchement. Cette boîte de branchement comporte une adénosine qui joue un rôle central dans le processus d'épissage. Normalement, introns plus grand que exons

Answer 39

Exon en amont et en aval de l'intron L'épissage s'effectue en deux étapes. d'abord une attaque nucléophile du 2'-OH du ribose de l'adénosine de la boite de branchement sur le phosphate de la jonction exon-intron en 5'. Le résultat de cette 1ere réaction c’est la libération de l’extrémité 3’ de l’exon en amont et une nouvelle liaison phosphodiester entre le 5’OH du premier nucléotide de l’intron et le 2’OH de l’adénosine de la boite de branchement 2- Ensuite, le 3'-OH libéré au niveau de l'exon en amont attaque le phosphate de la jonction intron-exon en aval. Les produits de cette réaction sont d'une part les deux exons ligaturés correctement et d'autre part, l'intron cyclisé au niveau de l'adénosine de la boîte de branchement. L’intron éliminé en forme de lasso est souvent dégradé. Transesterification

Answer 40

Complexe de 5 molécules d’ARN (appelées snARN pour petits ARN nucléaires) (U1, U2, U4, U5 et U6) Besoin d’ATP (RNA hélicase et changements de conformation) Le processus d’épissage est catalysé par le spliceosome. Le spliceosome implique 5 ribonucléoprotéines appelés U1, U2, U4, U5 et U6. Chaque RNP est formé par un petite ARN nucléaire et plusieurs protéines. Le processus d'épissage est un mécanisme dynamique qui suit une succession précise d'évènements au cours de laquelle les différentes petites ribonucléoprotéines nucléaires s'assemblent et se désassemblent du spliceosome. Les étapes clés sont : U1 s'associe au site 5' de épissage para appariement de bases complémentaires. U2 s'associe à la boite de branchement. U4 associé à U6 et U2 rapproche la jonction 5' de l'intron et la boite de branchement. U4 et U1 quittent le complexe. Le 2'-OH du A de la boite de branchement coupe la jonction 5' de l'intron. Le 3'-OH du nucléotide en 3' de l'exon amont coupe l'autre jonction. L'ARNm épissé et l'intron en « lasso » sont libéré A noter que les réactions chimiques de transestérification pendant l’épissage n’ont pas besoin d’énergie. Par contre le spliceosome contient des ARN hélicases qui hydrolyse l’ATP pour catalyser les changements de conformation requis pour l’épissage. U car beaucoup de uricil

Answer 41

Les produits d’épissage alternatif sont souvant spécifique aux tissus spécialisés (i.e. alpha-tropomyosine du muscle et du cerveau) Durant l'épissage de l'ARN, les exons sont soit conservés dans l'ARNm, soit ciblés en vue de leur élimination suivant diverses combinaisons qui mèneront à la création d'un réseau varié d'ARNm à partir d'un seul pré-ARNm. Ce processus s'appelle épissage alternatif de l'ARN. On pense qu'au moins 70 % des quelque 20 000 gènes qui composent le génome humain subissent un épissage alternatif et que, en moyenne, un gène donne naissance à 4 variants issus d'un tel épissage, pouvant donner naissance à environ 100 000 protéines différentes de par leur séquence et, du coup, leurs activités. Épissage alternatif : Nous permet de faire plusieurs protéines avec un même gène

Answer 42

c) La transesterification qui produit une liaison 5’-2’ phosphodiester entre l’extrémité 5’ de l’intron et le site de branchement.

Answer 43

RNA polymérase I : synthèse de l’ARN ribosomique Élément du contrôle central UCE: élément du command en amont UBF: facteur qui s’attache à UCE SL1 (selective factor 1) lie le complexe UBF-ADN, contient TBP (TATA binding protein) Le complexe d’amorçage permet la liaison de pol I 30-60% de la transcription La transcription de l'ADN ribosomique est confinée dans les nucléoles, où sont concentrées environ 400 copies des gènes de 32 kb de l'ARN ribosomique. Chaque copie contient une séquence d'environ 13,3 kb codant l'ARNr 18S, l'ARNr 5,8S et l'ARNr 28S parmi des espaceurs non codants qui sont par la suite clivés. La transcription est réalisé par l'ARN polymérase I et représente près de 60 % de la transcription dans les cellules en croissance rapide. Le facteur de transcription UBF contrôle la transcription par la pol I par liaison a UCE ou élément du control en amont. UBF recrute la pol I avec les facteurs généraux de la pol I connu comme SL1. Les facteurs généraux de la pol I sont spécifiques a la pol I mais nous trouvons aussi TBP.

Answer 44

RNA polymérase III : synthèse de l’ARNt et l’ARNr 5S Les régions de commande de la transcription des gènes d’ARNt siègent au sein de la séquence transcrite: boites A et B TFIIIC vient se lier aux boites A et B du promoteur TFIIIB arrive ensuite et recrute l’ARN polymérase III L’ARN polymérase III est responsable de la synthèse de petits ARNs comme les ARNt et l’ARNr 5S. Les promoteurs de la pol III comportent des séquences a l’intérieure de la région transcrit, ce qui est diffèrent pour les autres polymérases ou les éléments du promoteurs sont en amont du site d’initiation de la transcription. Le facteur général de la pol III TFIIIC lie les boit A et B qui définissent les promoteurs et recrute ensuite TFIIIB et la pol III. TBP fait partie aussi du facteurs généraux de la pol I.

Answer 45

ARN non codants: les petits ARN 2% du total (snARN, snoARN, miARN, autres) Petits ARN nucléaires (snRNA) -Petits ARN (1000 bases) contenant beaucoup de U, -Fortement appariés et modifiés et présents en grande quantité dans les noyaux (100 000) -Font partie de complexes protéines-ARN (snRNP) à multiples fonctions (ex: spliceosome) -Sm= site de liaison aux protéines Parmi les ARN non codants, nous avons plusieurs classes de petites ARNs qui jouent de rôle majeur dans la cellule. Les snRNA sont connus aussi comme U RNAs parce qu’ils contiennent beaucoup d’uracile. Nous avons vu leurs fonctions pendant l’épissage, par exemple U1 lie le site d’épissage 5’ et U2 la boite de branchement. Les ARN U font partie des complexes RNP. Une séquence nommé Sm dans le petites ARNs sert de site de reconnaissance pour les protéines Sm. Ces protéines ont été découvertes comme des antigènes ciblés par des anticorps anti-Sm chez une patiente ayant une forme de lupus érythémateux disséminé (LED), une maladie auto-immune débilitante. Elles ont été nommées Sm en hommage à cette patiente, Stéphanie Smith.

Answer 46

Introns du groupe I (protozoaires) Introns du groupe II (mitochondries) Autoépisssage: l’ARN catalyse toutes les réactions d’épissage Similarités entre les introns du groupe II et le spliceosome Autres ribozymes: hammerhead, hairpin, ribosome Le concept des enzymes fait en ARN a donné support a l’idée du monde ARN qui postule que les premiers organismes vivants étaient faits d’ARN. Les premiers ribozymes découvert catalyse l’auto-épissage des introns et la maturation de l’ARNt. Dans l’épissage qui se passe dans le noyau des cellules eucaryotes les complexes RNP que nous venons d’étudier catalysent les réactions de transesterifcation qu’éliminent l’intron et lient les exons. Il y a deux sortes des introns auto-catalytiques, ça veut dire leur épissage c’est fait sans protéines dans des réactions catalysés par l’intron lui-même. Les introns du groupe I et les introns du groupe II. La structure des introns du groupe II ressemble à plusieurs domaines présentes chez les petites ARN nucléaires qui catalysent l’épissage. On pense que les introns du groupe II sont à l’origine du spliceosome. Après ces découverts plusieurs ribozymes on étaient trouvé dans nombreuse organismes en incluant les ribozymes en tête de marteau et le ribosome.

Answer 47

RNAi: siRNA, miRNA, piRNA miARN = miRNA Épingles à cheveux = hairpins Interférence d’ARN: inhibition de l’expression des ARNm par des petits ARN interférents: siARN, miARN et piARN RNA a simple brin (en rouge) entre 20-30 ntds Précurseurs: RNA double brin (siARN, piARN) ou des épingles à cheveux (miARN) Fonctionne comme guides pour cibler des ARN spécifiques Pendant longtemps l’ADN et les protéines étaient le centre de l’attention en biologie. On avait découvert les ribozymes comme reliques du monde ARN, quelque chose du passé. Ont étudient les ARNt et l’ARNr mais parce que leur fonction c’est fabriquer les protéines. La découverte de l’interférence par l’ARN a changé tout ça. L’ARN interférentes sont des trois types, les siRNA, les miRNAs et le piRNAs. D’abord ce sont des ARN très courts, entre 20 et 30 ntds. Ensuite ils sont très abondants et finalement ils régulent l’expression de plusieurs gènes comme les facteurs de transcription. Leur mécanisme d’action est très simple, ces ARN fonctionnent comme guide pour reconnaitre des ARN spécifiques soit des ARNm ou des ARN aberrantes et toxiques produites par les transposons et les séquences répétées qu’ont envahi le génome. Craig Mellow et Andrew Fire ont reçu le prix Nobel en 2006 pour ce découvert.

Answer 48

La voie d’interférence à l’ARN commence par un ARN double brin Dicer catalyse la conversion de l’ARN double brin en siARNs double brin de 21 ntds RISC (RNA-induced silencing complex) choisit un brin de l’ARN double brin comme guide RISC a une activité de coupure de l’ARN cible La voie d’interférence à l’ARN commence par un ARN double brin, plusieurs ARN des transposons forment de régions en double brin intra caténaires entre séquences complémentaires. L’enzyme Dicer catalyse la conversion de l’ARN double brin en siARNs double brin de 21 ntds. Un complexe de protéines nommé RISC (RNA-induced silencing complex) choisit un brin de l’ARN double brin comme guide. Le guide dirige RISC vers un ARN cible. RISC détruit l’ARN cible para une activité endonucléase. L’interaction entre le siRNA et la cible suit les règles des appariements Watson-Crick. Nous pouvons designer un siRNA spécifique contre n’importe quelle mRNA que nous voulons inactiver. En fait nous utilisons les siRNA beaucoup en recherche et leur potentiel thérapeutique a déjà commencé à être exploité. Je vous invite a écouter la capsule sur un siRNA thérapeutique après le cours.

Answer 49

miARNs: 1400 chez l’homme Deux domaines: seed et 3’ région Un miARN: plusieurs cibles (200), car il forme des paires de bases plutôt avec le « seed » (6-7 ntds) Avec miARN, RISC ne coupe pas les cibles, mais plutôt inhibe leur traduction Les miRNAs sont produits à partir des gènes spécifiques transcrit par l’ARN polymérase II en forme d’un précurseurs nommé pri-miRNA. L’enzyme Drosha converti le pri-miRNA en un précurseur en épingle a chevaux nomme pre-miRNA, qui est exporté du noyau et ensuite suit la même voie de biogenèse que les siRNA, ça veut dire coupé par Dicer et un de brins de l’ARN double brins résultant et transféré au complexe RISC pour servir comme guide pour chercher des ARN cible. La différence la plus importante entre un siRNA et un miRNA est en fait le dégrée de complémentarité avec l’ARN cible. Le siRNA est complémentaire a la cible tout au long de sa séquence de 21 ntd. Par contre les miRNAs préfère apparier les nucléotides 2-8 et tolère des mésappariements entre les nucléotides 9-21. La région entre les ntd 2-8 du miRNA est connu comme le « seed » du miRNA. Une conséquence des mésappariements ce que les miRNAs ne peuvent pas couper leur cible par l’activité endonucléase de RISC. Leur effet est du à une inhibition de la traduction et au dégradation de l’ARN médié par le recrutement des exonucléases cellulaires. La plupart des interactions fonctionnelles entre un miRNA et les ARNm cibles se passent dans la région 3’ non traduit de l’ARNm, ça veut dire après la séquence codant de l’ARN ce région est nommé le 3’UTR.

Answer 50

Un miARN peut agir comme régulateur important de l’expression d’un gène (interrupteur) ou aider à la mise au point de l’expression Comme les miRNA ne coupe pas leur cible, leur capacité pour réprimer l’expression des ARN cible est plus faible. En fait souvent les miRNAs vont faire la mise au point de niveaux d’expression. Par contre dans quelques cas les miRNA peuvent réprimer complètement l’expression d’un gène. En général un miRNA a plusieurs cibles, mais pour la plupart de ces cibles sont effet est léger, et seulement quelques cibles sont réprimés complètement.

Answer 51

CRISPR-Cas9 tire son origine d'études très fondamentales du génome bactérien. En 1987, un équipe de l'université d'Osaka, au Japon, découvrent de curieuses séquences d'ADN répétitives dans le génome de bactéries Escherichia coli. Ils l’ont baptisé CRISPR (acronyme anglais pour « courtes répétitions en palindrome regroupées et régulièrement espacées »). En 2007, des chercheurs de l'industriel laitier danois Danisco découvrent que lorsque les bactéries qu'ils utilisent pour fabriquer des yaourts et des fromages ont des séquences CRISPR, elles survivent mieux aux infections virales. « Il s'agit d'une sorte de système immunitaire capable de garder la mémoire d'une agression par un virus ou une séquence d'ADN étrangère, afin de combattre ce même agresseur lorsqu'il envahit à nouveau la bactérie », Comme ARNi, CRISPR utilise des RNAs guide pour reconnaître des séquences spécifiques. Dans le système CRISPR une nucléase nommé Cas9 utilise les ARN guides pour chercher la cible. Par contre CRISPR-Cas9 cible l’ADN . CAS= Crispr-associated protein C’est la première fois qu’un duo 100 % féminin remporte un Nobel scientifique : le prix de chimie a été attribué à la Française Emmanuelle Charpentier et à l’Américaine Jennifer Doudna, deux généticiennes qui ont mis au point des « ciseaux » capables de modifier les gènes humains, une percée révolutionnaire. CRSIPR a la même simplicité que ARNi mais CRISPR cible l’ADN. L’ARN guide pour le système CRISPR est nommé sgRNA (small guide RNA). Le sgRNA peut être désigné pour cibler n’importe quelle région de l’ADN en utilisant les règles the complémentarités de base de WC. L’endonucléase Cas9 utilise le sgRNA comme guide et coupe l’ADN dans une région précise. Après la coupure, les mécanise de réparation de l’ADN du type NHEJ essaie de réparer l’ADN coupé mais le résultat est souvent un ADN qui a gagné ou perdu des nucléotides. Alors, s’il s’agit d’un gène qui code pour des protéines CRISPR inactive ce gène pour toujours’ c’est permanent. Nous pouvons utiliser le système aussi pour réparer des gènes via recombinaison homologue. En fait si nous ajoutons un fragment d’ADN, CRISPR stimule la recombinaison homologue entre ce fragment et son homologue dans le génome. De cette façon nous pouvons corriger un défaut génétique.

Answer 52

Des bébés génétiquement modifiés en Chine Alors que la Chine vit une croissance du taux d’infections à VIH et sida de 14%, un chercheur chinois, He Jiankui a annoncé en 2018 la naissance de deux bébés génétiquement modifiés résistants au VIH. CRISPR-Cas9 auraient modifié le gène CCR5 des embryons, essentiel à l’infection des cellules par le VIH, avant de les implanter dans l’utérus de la mère. Par ailleurs, à la naissance, les jumelles n’étaient pas infectées par le virus du sida. Le chercheur a été incarcéré trois ans, après avoir défrayé la chronique en 2018. En bref : l’édition de la ligne germinale crée des changements que les descendants d’une personne peuvent hériter, par opposition aux changements qui ne pourraient pas être transmis aux générations futures.

Answer 53

c) Nucléoles

Answer 54

La transcription se fait sur une matrice d’ADN 3'-5' dans la direction 5'-3'.

Answer 55

c) ATP, GTP, CTP, UTP

Answer 56

b) 5’-GUCCGAUCGAAUGCAUG-3’ Puisque l'ARN polymérase utilise le brin non-codant comme matrice, elle reproduit sous forme ARN un brin complémentaire qui a la même séquence 5'-3' que l'ADN codant.

Answer 57

a) K4 méthylation et K9 acétylation

Answer 58

b) Reconnu par TBP TBP signifie d'ailleurs TATA-binding protein.

Answer 59

d) TFIIH Les sous-unités CDK7 et CDK9 sont requises pour cette activité kinase de TFIIH.

Answer 60

b) Synthèse d’un signal de terminaison dans l’ARN. La synthèse d'une structure en épingle à cheveux et d'une région riche en A/U ralentissent la polymérase puis déstabilisent l'hybride ARN/ADN, menant à la terminaison de la transcription. La synthèse d'une région riche en C permet aussi le recrutement du facteur Rho pour la terminaison Rho-dépendante.

Answer 61

a) Lier le TATA box En effet, lier le TATA box est une fonction des facteurs généraux de transcription, plus spécifiquement de la sous-unité TBP dans le facteur TFIID.

Answer 62

b) Facteurs de transcription. Les facteurs de transcription spécifiques ou activateurs, peuvent agir à distance du promoteur pour ouvrir la chromatine autour de la région promotrice.

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