cours 11 mcb2399 Flashcards
(42 cards)
comment augmenter la production de protéines
- augmenter copies ADN
- augmenter ARN
- augmenter traduction
en quoi consiste le design des purification
isolation à partir des tissus/cellules
production dans un système d’expression: bactérie, levure, cellule mammifère, plante, cellule insecte, in vitro
quels sont les avantages/désavantages de l’expression protéique in vitro
+ : pas besoin de clonage, rapide, plusieurs expressions simultanément, production protéines difficiles ou toxiques
- : cout, faible quantité matériel, ADNc pour protéines eucaryote
en quoi consiste l’expression protéique in vitro
- ajout ADN/ARN pol
- ribosomes
- incubation
- synthèse protéine
- purification
en quoi consiste l’expression protéique utilisant les bactéries
avec des vecteurs:
- promoteur fort
- codons optimisés
- signaux traduction optimisés
- tag affinité pour faciliter purification (his-tag)
- fusion à protéines bactériennes
- épitopes reconnus par Ac
caractéristiques du plasmide pGEX pour expression protéique chez E.coli
- partie N-terminale GST
- site protéases
- besoin de cloner dans bon cadre de lecture
- promoteur inductible à IPTG (possède lac-)
principe de purification des protéines
(globale)
- lyse cellulaire
- centrifugation
- précipitation a.n
- précipitation protéines
- chromatographie
- obtention protéine pure
quels sont les procédés de séparation de protéines
- précipitation
- chromatographie
- électrophorèse
- centrifugation
- ultrafiltration
comment faire la lyse bactérienne
- produits chimiques
- conditions alcalines
- traitement enzymatique
- traitement physique
quels produits chimiques utilisés pour la lyse bactérienne et quel est l’avantage des produits chimiques
- détergent
- antibio
- solvants
- agent dénaturant
moins de chance de dégradation
quels sont les traitements physiques utilisés pour la lyse bactérienne et quels sont leur désavantage
- sonication
- homogénisation
- agitation avec abrasifs
- gel-dégel
possibilité de dénaturer
pourquoi faire des précipitations pour purifier protéines
- éliminer bonne partie des protéines non désirées
comment se fait la précipitation avec le sulfate ammonium
salting-out:
bcp sel: provoque agrégation des protéines= précipitation
ions kosmotrope vs chaotrope
kosmotrope: sulfate d’ammonium: augmentation concentration permet précipitation stable
ions kosmotropique = ion stabilisant
chaotrope: urée: augmentation concentration cause dénaturation
ion chaotropique = ion dénaturant
à quoi peut servir la dialyse
changer composition des solutions:
solution dans membrane semi-perméable: permet échange ions mais pas protéines
comment fonctionne l’ultrafiltration
comme dialyse en utilisant centrifugeuse pour faire traverser tampon à travers un filtre
la charge des protéines dépend de quoi
séquence a.a (point isoélectrique)
pH solution
en chromatographie qu’est-ce que le flow through
ce qui n’interagit pas avec résine
différence entre gradient linéaire vs en étape en chromatographie
linéaire: plus de pics
étape: plus plus larges
comment fonctionne la chromatographie d’exclusion/filtration sur gel
selon taille: si trop gros: va pas lier pores donc va éluer plus vite
caractéristiques de la chromatographie aux interactions hydrophobes
- 8 a.a hydrophobes
- souvent caché à intérieur protéine
- résine possède groupements hydrophobes lié au gel agarose
- utilisation gradient décroissant
comment fonctionne la purification des protéines his-tag par chromatographie d’affinité
- tag protéines avec his
- résine: nickel
- nickel et his interagissent
- élution avec imidazole qui compétitionne avec his
quels types de résine peut-on utiliser en chromatographie d’affinité
- Ni-NTA (protéine his-tag)
- amylose (protéine MBP)
- glutathione (protéine GST)
- chitine
- anticorps spécifiques
comment mesurer l’activité proétique par unité d’activité d’une protéine
quantité substrat converti en produit final selon le temps et avec des conditions pré-établies
ex: µmol de produit/min
