cours 12 mcb2399

Question 1

que permet de voir la microscopie optique

Answer 1

• forme
• croissance
• expression génique
• motilité cellules individuelles
• structures intracellulaires
• dynamique intracellulaire

Question 2

quelles sont les techniques de microscopie

Answer 2

• optique
• électronique
• à force atomique

Question 3

avantages microscopie optique

Answer 3

• lumière visible
• cellules vivantes
• spécifique avec fluorescence
• résolution quand même faible (250nm), mais super-résolution: 10-50nm
• 3D pour échantillons épais (confocale)
• peut mesurer orientation, interactions, identité moléculaire

Question 4

avantage microscopie électronique

Answer 4

• électron comme longueur onde
• résolution la plus élevé (0.1 nm)

Question 5

comment était le premier microscope

Answer 5

loupe et lentille: grossissement 300, résolution 1um
par Leeuwenhoek

Question 6

comment fonctionne le microscope de base à 2 lentilles

Answer 6

objectif et occulaire ou lentille de projection

Question 7

que permet l’ajout d’une lentille de tube

Answer 7

espace infini: image se forme à l’infini

Question 8

avec les microscope réguliers, quel est l’avantage d’utiliser plusieurs lentilles

Answer 8

• contrer aberrations chromatiques (puisque lumière focalise à des points différents)
• minimiser erreurs de perceptions (artefacts optiques)

Question 9

différence en champ claire entre illumination critique et Kohler

Answer 9

Kohler a une lentille collectrice et un condenseur (pas en critique)
permet de former image à infini pcq rayons sont //

Question 10

quel est le problème avec le champ clair

Answer 10

difficile voir échantillons pcq transparents

Question 11

comment ecq contraste de phase permet de mieux voir que champ claire

Answer 11

• pcq retarde lumière, permet de transformer les différences de phases en différence intensité
• ajout plaque de phase et condenseur
• retardation: ∆x = h* indice de réfraction

indice réfraction: (ncellule - nmilieu)

Question 12

ecq retardation et différence de phase même chose

Answer 12

oui?

Question 12

qu’est ce que le SLIM

Answer 12

• spatial light interference microscopy
• permet de mesurer la retardation
• variant de contraste de phase
• permet déduire masse sèche

Question 13

comment ecq SLIM permet de déduire la masse sèche

Answer 13

indice de réfraction proportionnel à densité masse des solutés

Question 14

que permet holotomographie

Answer 14

reconstruction 3D
prise images de plusieurs côtés

Question 15

qu’est-ce que la photométrie de masse

Answer 15

mesure masse molécule unique en temps réelle

microscope réflexion: dèes 1 molécule se lie, change réfléxion lumière à surface

Question 16

caractéristiques epi-fluorescence

Answer 16

• filtre excitation et émission
• miroir dichroique

Question 17

quelles sont les caractéristiques importantes de la fluorescence

Answer 17

• longueur onde maximale excitation et émission
• coefficient absportion molaire/extinction: capacité d’une molécule à être excité
• rendement quantique: nombre photons excitation produisant fluorescence
• éclat: coefficient absorption * rendemen quantique/ 1000
• photoblanchiment: perte fluorescence à cause ROS
• poids moléculaire

Question 18

caractéristiques fluorescine

Answer 18

• protonation (bas pH): réduit fluorescence
• rigidité symétrie permet rendement quantique élevé

Question 19

comment coefficient extinction change selon longueur onde

Answer 19

augmentation longueur onde: augmentation coefficient

Question 20

relation entre éclat et longueur onde

Answer 20

augmentation longueur onde, augmente coefficient, augmente éclat

Question 21

comment ajouter des colorants fluorescents aux biomolécules

Answer 21

• protéines: a.a nucléophiles: substitue avec groupes électrophile
• amines

Question 22

exemples de colorants labelisant d’autres molécules

Answer 22

fluorogène: s’allule seulement quand lié
- DAPI: colore ADN
- colorant lipophilique colorant membrane

Question 23

comment utilisé des dyes fluorescents

Answer 23

avec tags, peptides ou protéines qui sont ciblés par dyes

Question 23

que permettent les colorants labelisant la paroi peptidoglycane

Answer 23

- combinaison de plusieurs colorants pour time lapse de synthèse paroi - D-ala marqué quand ajoute dans synthèse: permet voir - avec coumarin, TMR, NBD-F)

Question 24

caractéristique GFP

Answer 24

- provient méduse - 3 a.a au centre tonneau beta: thréonine, tyrosine, glycine - possible de changer les a.a pour changer caractéristiques fluorogéniques - besoin de maturation: va prendre du temps avant de le voir - photoblanchiment (10x plus vites que fluorophores organiques)

Question 25

comment se fait la maturation de la GFP

Answer 25

1. rotation a.a. 2. cyclisation entre thr et glycine 3. oxydation tyrosine par oxygène moléculaire étape 3: étape limitante (5-60min)

Question 26

exemple de sonde moléculaire

Answer 26

Queen-m2: mesure concentration ATP dans cellule - GFP lié à une ATPase - selon si lié ou non à ATP: change le spectre excitation (pas émission) | PHluorin (pH), HyPer (ROS), GCamMP (calcium)

Question 27

caractéristiques FRET

Answer 27

- transfert énergie non-radiatif entre donneur et accepteur - besoin overlap entre spectre donneur et accepteur - efficacité selon distance R entre 3 et 7nm

Question 28

quelle est la limite de la microscopie a épi- fluorescence

Answer 28

diffraction: image apparait flou si distance trop petite que: d = 0.6longueur onde/NA c'est la limite de résolution limité à direction Z

Question 29

qu'est-ce que la NA

Answer 29

ouverture numérique de objectif - selon la distance travail

Question 30

la limite de résolution est indépendante de quoi

Answer 30

grossissement objectif

Question 31

comment résoudre le problème de signal de fond

Answer 31

- utilisation TIRFM: laser avec grand angle, fait reflété complètement, capable de voir jusqu'à hauteur de 200nm (peut juste voir ce qui est proche de la lamelle), besoin laser - confocale à balayage laser: lumière excitation focalisé sur un point, seulement lumière émise détectée (grâce pinhole), balayage à travers échantillon permet visualiser 3D

Question 32

avantages et désavantage microscope confocale balayage laser

Answer 32

+: réduction signal de fond, meilleur résolution -: réduit signal (perte photons), photoblanchiment par forte illumination

Question 33

qu'est-ce que la super-résolution

Answer 33

- permet voir structure intracellulaire de bactéries STED: 1. laser excitation 2. laser dépletion forme beigne (éliminer molécules qui ne se trouve pas directement dans point du laser excitation) 3. résolution théorie 0, mais 20-50nm