Do VL 4 - 6 Flashcards

Question

Southern Blotting!

Answer 1

DNA-Detektierung mH einer DNA-Sonde! • Schritte! 1. Restriktionsverdau von DNA! 2. Auftragung auf Gel! 3. transfer der DNA aus Gel auf Membran (feste Unterlage)! - da Membran physikalisch stabiler ist als Gel! - zB Nylonmembran; Nitrocellulose! - zeigt auf Membran, wie DNA vorher im Gel gelaufen ist! 4. Hybridisierung mit markierter Sonde! - 2 Komplementäre Einzelstränge! - zum Finden des Gens, welches mich interessiert! - die Sonde gibt man in Lösung (vorher ssDNA durch Erhitzen)! - Lösung wird durch Gel+Membran gezogen —> DNA wird auf Membran übertragen! - dort wo komplementäre Stränge sind im Gel, werden diese hybridiesiert und es gibt markierte Stellen in Membran! - Sonde ist radiomarkiert zB 32P! 5. Autoradiogramm —> schwärzen eines radio-Films an Stellen mit Sonde!

Answer 2

Ergänzung zum Southern Blotting! • RNA-Detektion mit DNA/RNA-Sonden! • äquivalent zu Southern! !• Anzahl der überprüfbaren Proben abh. von Gel-Größe!

Answer 3

Protein-Detektion mit Antikörper(-Sonde)! !• Protein-Gel; ähnlich Southern!

Answer 4

Sonde befestigen auf Unterlage; Probe fest! • Sonde mit kleinen „Pünktchen“ auf Objektträger (=Chip)! - man kann viele Sonden auf kleinen Raum aufbringen und Probe auf versch. Gene prüfen! - RNA wird reverse transkribiert —> DNA die man testet! • DNA wird in Probe fluoreszenzmarkiert! - wenn DNA für Sonde in Probe, fluoresziert Sonden-Punktchen! • Gesamt-RNA —> cDNA —> Markierung —> Hybridisierung auf Chip! • Signalintensität korreliert mit cDNA-Menge im Gemisch (Probe)! • funktioniert auch mit mehreren Proben! —> verschiedene Fluoreszenzmarker! • Sonden:! - Oligonukleotide —> leicht synthetisierbar! - werden zT gleich auf Chip synthetisiert —> printing!

Answer 5

- Abfolge von Nukleotiden —> Oligonukleotide überlappen partiell und decken so Gen ab! ! • Anwendung! - Nukleotidpolymorphismus feststellen ! • Problem:! - Begrenzt durch spezifische Auftragung auf Array —> andere DNA hybridisiert nicht! - man muss Gene kennen!

Answer 6

Sanger-Sequenzierung (klassisch)! - Didesoxy-Nukleotid-Sequenzierung; Kettenabbruchmethode! - man gibt Nukleotide hinzu, die kein 3OH Ende haben ! ! —> wenn diese eingebaut werden, kann Pol nicht weiter Nt anhängen! ! - - - - ! => Kettenabbruch! man erhält unterschiedl. lange Fragmente! Didesoxy-Adenin (Abbruch direkt bei Adenin); Didesoxy-T/C/G..! Auftragung auf Gel ! mit allen Basen komplette Sequenzierung!

Answer 7

Schritte! 1. an DNA-Probe bindet man Linker-Seq.! 2. Probe wird auf Cluster gegeben! 3. Linker binden an Cluster-Linker! 4. Polymerase transkribiert —> viele Millionen Kopien! 5. Hinzugeben von markierten Nukleotiden, welche fluoreszieren, wenn sie gebunden werden! • Anwendung! - Transkriptions-Squenzierung! - RNA-Sequenzierung! - WGS! - Cancer genomics! - Mikrobiom (zB der Hautfauna, man sequenziert alles)! - Single cell transcriptomics!

Answer 8

nicht nur ein Protein identifizieren! | !• sondern effiziente Methode um viele Proteine in einem Gemisch zu erkennen!

Answer 9

Identifizierung eines Peptids anhand der Masse! • man kann nur Stücke, keine ganzen Proteine identifizieren! ! => Fragmentierung des Proteins! Verfahren! A. MALDI=matrixassistedlaserdesorptionionization! B. ESI=elektro-spray-ioniz.! LC-MS = Liquid-Chromatographie-MS! ! > Massen werden sauberer, wenn man nur von einem Peptid bestimmt! ! ! als das ganze Gemisch zu bestimmen! man erhält Peaks! vergleich mit Datenbank! de-novo-Sequenzierung möglich! ! > man beschießt Peptid mit Partikeln —> Peptid bricht (vorwiegend am Rückrad) ! - proteolyt. Verdau via Trypsin! • MS der Fragmente! • Fragmente unterschiedliche Massen—> aus Diff erhält man Masse des Peptids/Proteins! !• Vergleich von versch. Proben schwer!

Answer 10

• stable Isotope labeling with AS in cel culture! • AS sind mit schweren Isotopen (zB 13C) (Eigenschaften nicht beeinflusst) markiert! - charakteristische Massendifferenz zw schweren und normalen Peptiden (kann man wegrechnen)! • eine Probe mit Isotop markiert, andere normal! • eine wird gestresst, andere nicht! • dann zusammenbringen! - —> Vergleich des Massendifferenz best. Peptide per MS und gucken inwieweit sich Massenverhältnis geändert hat!

Answer 11

!• Bestimmung der Funktion von bestimmten Genen!

Answer 12

P-Element (Transposon) aus Drosophila in dem lacZ inseriert ist, in der Nähe der inverted repeats! • dann Transposition dieses Transposons in der Drosophila, vll springt es dann in der Nähe eines Enhancers, eventueller knock out —> lacZ wird expressioniert —> dann screent man die Probe auf lacZ!

Answer 13

man kann die Expression eines Enhacers/Promotors betrachten! • Gal4 Transkriptionsfaktor! • UAS Upstram activating sequence! • Gal4 funktioniert in vielen verschiedenen Organismen! ! ! ! ! VL 7 — Genome Editing! ! ! —> dadurch ein Gewebe markieren! —> und gewebespezifische Knock-outs

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