Einzelmolekülmethoden Flashcards
(93 cards)
1
Q
Was wird in einem Jablonski-Diagramm dargestellt? Welche Zustände und welche Übergänge gibt es?
A
- veranschualicht mögliche Übergänge von Valenzelektronen in die versch. Anregungszustände bei Einstrahlung von Licht und zurück
- anschualich für Fluoreszenz und Phosphoreszenz
- Singlet: elektronische Energielevel (dicke Linien) –> Vibrations energielevel: dünne Linien
- Triplet (spin flip)
- IC: ns
- ISC: µs
- RISC:µs
- Kollision (sehr schnelle Vibrationsrelaxation)
- Floureszenz: ns
- Phosphoreszenz; µs
- keine Diagonalen, sondern nur vertikale und horizontale Linien
2
Q
interne Konversion
A
(Umwandlung von Energie: Elektrsch zu Vibrationsenergie) –> Hängt von Dichte der States ab –> höhere Energie bei kleiner Dichte
3
Q
Intersystem crossing
A
aus einem angeregten Singletzustand in Triplettzustand
4
Q
Reverse intersystem crossing
A
- umgekehrte ISC
- unwahrscheinlich
- von triplet zu Singulett
- auf S0
5
Q
Wie kann man die Änderungen der Besetzung der Zustände in Form von Differentialgleichungen ausdrücken?
A
- Ratengleichungen (Kohärenz und stimulierte Emission)
n: Energieniveau (elektrisch) - n1: (s0,0): = - Flussdichte * Absorptions cross section *n1+kradn2 + kicn2 + kriscn3 (das was auf den Zustand zu geht +, was weg geht: -)
analog für n2 und n3 - n/dt –> Änderung der Besetzungen
6
Q
Wie lange dauert es, bis ein Photon absorbiert wird?
A
- das Photon muss das Molekül treffen
- Rste: Inverses der Zeit
- Absorptionsrate R = Flussdichte * Absorptionscross Sektion (Fläche)
- Einheit: Photonen/Fläche*Zeit
- Intensität: I = Energie/Fläche*Zeit
- sigma: Absorptionsquerschnitt
- phi: Photonenfluss
7
Q
Was ist eine stationäre Lösung, und wie hängt im stationären Zustand die Besetzung des ersten elektronisch angeregten Zustands von der Anregungsrate ab?
A
- alle Ableitungen nach der Zeit sind =0 –> keine Dynamik
- state n2 am interessantes, weil hiervon Floureszenz ausgeht
- Emissionsrate R = n2 * krad (besetzung des el. 1. angeregten Zustands * Strahlungsrate (Floureszenz))
- R = krad/ (1+ kisc/krisc + krad+kic+kisc/ Phi sigma)
- kic und kisc können vernachlässigt werden, da «_space;krad
- bei geringer Anregung: phisigma< krad/phisigma wird sehr groß –> die anderen Summanden im Nenner können vernachlässigt werden, krad kann gekürzt werden–> R = phi * sigma = Rexc –> Fluoreszenzemissionsrate etnspricht der Anregungsrate –> Photonflussdichte erhöhren –> linearer Zusammenhang –> mehr Floureszenz
- Molekül meist im Grundzustand –> Anregungsrage ist limitierender Faktor
- bei hoher Anregung: phi*sigma»_space; krad –> hinterer Summand vernachlässigbar –> R = krad/ (1+ kisc/krisc) –> Anregungsrate spielt keine Rolle. Zeit zwischen Photonen nur gegeben dadurch, wie lange Molekül im angeregten Zustand ist
- Sättigung wird verstanden
8
Q
Was ist die Sättigungsintensität?
A
- Emissionsrate über Intensität
- Sättigungsflussdichte (nicht wirklich Intensität)
- Phisat = krisc/sigma * (krad+kic+kisc)/(krisc+kisc)
- -> R = Runendlich * 1/(1+Phisat/Phi) (R ist Fluoreszenzsignal als Funktion der Laserintensität)
- Sättigungskurve
- für I = Isat –> R = Runendlich * 1/2
- gilt für lange Zeit, sowie für singlet cycling
- am Anfanf mehr oder weniger lineare Zusammenhang
- bei höherer Laserleistung –> Kurve
- erreicht Sättigung –> auch stärkerem Laser, Floureszenz kann gewissen Wert nicht überschreiten –> durch Lebenszeit des S1 begerenzt
9
Q
Warum ist Emissionsrate nicht nur durch die Strahlungsrate krad bei hoher Anregung gegeben?
A
- es gibt nicht nur den Floureszenzprozess, sondern kisc und kic
10
Q
Was passiert wenn Molekül in Triplettzustand geht?
A
- während Molekül im Triplettzustand ist, kann keine Floureszenz stattfinden, da dies ein Prozess im Singuelttzustand ist (singlet cycling) –> Dunkelperiode
11
Q
Wahrschienlichkeit, dass das Molekül in den Triplettzustand übergeht
A
kisc/krad (µs/ns) –> 10^-3 –> nach 1000 Zyklen ISC tritt auf
- wie schnell ist davon abhängig, wie schnell die Zyklen sind
- kisc app = 1/average time in singlet cycling –> average time hängt von der Anregungsrate ab
12
Q
Wie kann man das Zeitverhalten der Emission einzelner Photonen eines Einzelmoleküls beschreiben?
A
- Interphoton time
- abhängig von Laserintensität –> Fluoreszenz ändert sich
- Phase 1: Zusammenhang linear –> viel Zeit zwischen den Photonen –> Interphoton time»_space; 1/kisc, 1/krisc (ms oder größer) Interphoton time = 1/Rexc = 1/ phi*sigma
- Phase 2: Interphoton time < 1/kisc, 1/krisc aber immern noch 1/Rexc (µs oder kürzer) –> R während singlet cycling erhöht sich mit der Anregungsrate Rexc, T1 (µs) ist unabhängi von der Anregung (Laserfluss phi) –> wegen Dunkelperioden kein linearer Zusammenhang
- Phase 3: Sättigung: Interphoton time = 1/krad «_space;1(kisc, 1/krisc, Triplettzustand (µs) –> unabhängig vom Laserfluss
- kürzeste Zeit für singlet cycling ist abhängig davon, wie lange Molekül im S1 Zustand ist (Fluoreszenz ist immer spontaner Prozess) –> sobald das Molekül wieder im Grundzustand ist, wird es direkt wieder in den S1 Zustand angehoben
- Photonemission hängt von der Anregungsrate ab (phi sigma)
- kisc und krisc sind Triplettrate –> Eigenschaften des Moleküls
- krad –> Photonemission (Fluoreszenz) –> Eigenschaft des Moleküls (wie sigma (Absorptionscrossection)
- interne Konversion hier nicht berücksichtigt, da Virbationsrelaxation sehr schnell ist und nur von kic bestimmt wird (kein anderer EInfluss)
Autokorrelationsfunktion? –> bunch und Antibunch
13
Q
Fluoreszenz Quatenausbeute
A
- drei Möglichkeiten aus S1 wieder in S0 zu kommen (kisc, krad und kic)
- Wert zwischen 0 und 1
–> Emittierte Photonen/Absorbierte Photonen
= krad/(kic+kisc+krad) = krad Tf - kisc ist vernachlässigbar ( da etwa Faktor 1000 kleiner als krad)
- kic hängt von Dichte der Vibrationszustände des Grundzustands ab
- Dichte der Vibrationslevel sinkt je höher man energetisch geht –> kic erhöht sich mit sinkender Energiedifferenz von S1
- Fluoreszenzquantenausbeute sinkt mit höherem kic
Fluoreszenzausbeute sinkt je weiter im roten Bereich ( kleinerer Abstand zwischen S0 und S1 –> geringere Energie der emittierten Photonen –> rote Fluoreszenz –> haben generell also eine geringe Ausbeute)
14
Q
Was versteht man unter Photon Bunching/Antibunching?
A
- Singueltt Zeit Regime: Antibunching
während des Singlett Cycling sind die Photonen gut getrennt (kein Bündel von Photonen) - es ist immer ein Abstand zwischen den einzelnen Photonen, sie können nciht näher aneinander abhängig von krad: Abstand: mind 1/krad
- Molekül hat Photon emittiert, dann braucht es diese Zeit, um wieder eins emittieren zu können (Lebensdauer des Zustnds)
- Wahrscheinlichkeit von n2 ist größer 1, also größer der Durchschnitt
Photonbunching: Triplett Zeitskala –> Photonen werden gebündelt
- Singlett cycling –> Bunch von Photonen entsteht –> werden getrennt durcvh langlebige Triplettzustände –> dann Singlettcycling von neuem –> Bunch
- verringert die Besetzung von S1, erst bei längeren zeitskalen (µs)
- abhängig von laserintensität
15
Q
Dynamische Lösung
A
- zeitliche Entwicklung vom ersten Singletstate S1 (wie er besetzt ist)
- Startbedingungen: n1 = 1, t = 0, n2 = n3 = 0
- n2 als Funktion der Zeit: Wahrscheinlichkeit, ein Photon zu detektieren am Zeitpunkt t
- normalisieren der n2-Besetzung mit durchschnittlichen Besetzung –> für lange Zeiten gleicht n2 dem Durchschnitt von n2
- Verständnis, wie temporäre Fluktuation Wahrschienlichkeit der Lichtemission beeinflussen
- -> bei höherer Intensität –> Verschiebung in kürzere Zeitskalen
16
Q
Dynamische Lösung Graph
A
- n2(t)/ über der Zeit (log) (da großer Zeitbereich abgedeckt werden muss logarithmisch)
- t = 0: Wahrsch., dass Molekül in S1 = 0 –> danach erhöht sich Wahrschienlichkeit abhängig von Emissions Rate und Anregungsrate (krad + 2kexc)
- danach Abfall im Photonbunch –> Triplett reduziert die Wahrschienlichkeit, dass Molekül sich im n2 - zustand befindet
- wenn t –> unendlich –> Durchschnitt von n2 wird erreicht
17
Q
Welche Quellen für Hintergrund gibt es in einem Fluoreszenzexperiment?
A
- generelles Problem: Fluoreszenz eines einzelnen Moleküls ist sehr gerung
- Laser induziert (prop. zur Laserenergie)
- -> Farbfilter, um Laser- und Fluoreszenzlicht zu trennen
- Streuung (sofortig, skaliert mit der Konmzentration der Streuer)
- -> Rayleigh (gleiche Wellenlänge wie die Anregung)
- -> Raman: Vribrationsniveaus involviert ( redshifted zur im Vergleich Anregung verschoben) –> gestreutes Photon hat eine geringere Energie –> Ramangestreutes Licht kann gleiche Wellenlänge wie Floureszenz haben –> Farbfilter nicht möglich
- -> Reflektion an Oberflächen (sofortig)
- Hintergrundfluoreszenz (Durch Unreinheiten, Pufferlösungen zum Beispiel): tritt verzögert auf (redshifted)
- nicht laserinduziert: Detektor Dunkelsignal (thermische Anregung) –> Kühlen des Detektors, um diese zu reduzieren
18
Q
kisc, eff (app)
A
- gegeben durch die Besetzung von n2 mal die tatsächliche kisc * kisc (singlett cycling Durschnitt hat einen Maximum = 1 für eine Anregungsrate, die gegen unendlich geht)
- bei höherer Anregungsrate –> höhere Besetzung in n2 –> Photonen während Singlett cycling werden etwas näher zusammen gebracht (soweit krad es zulässt) –> je mehr sie zusammen gbracht werden, desto höher ist die Besewtzung des n2 Zustandes
- erhöht sich mit erhöhender Laserleistung –> Anstieg in der gesamten Rate
- führt zu einem Shift zu kürzeren Zeitskalen
- bei geringer Laserlistung werden die Singlettzyklen Zeitperioden länger
- wenn kisc, eff sehr nierdrig wird der Term von krisc dominiert –> Grenze für diesen Shift
für hohe Anregungsrate: Shift nach links von Anstieg und Abfall
19
Q
Was ist das Signal-Rausch-Verhältnis, und wie hängt dieses von der Anregungsleistung ab?
A
- Detektionsrate und SNR über Laserintensität aufgetragen
- Signal ist selbst auch im rauschen enthalten
- Rauscehn: Standardabweichung vom kompletten Signal
- komplettes Signal: Single Molecule + Hintergrund
- Rauschen:
Laserintensität: induziert Hintergrund (linear)
Detektordunkerate: Konstante
-Signal:
Fluoreszenzsignal: Detektionseffizienz*Emissionsrate (wie viel Prozent der Fluoreszenzphotnen werden detektiert?)
Sättigungsverhalten
Am Anfang der Kurve messen –> geringere LAserleistung, aber immer noch ein großer Anstieg von SNR zwischen zwei Punkten
Nicht am Maximum messen (höhere Laserleistung erforderlich)
20
Q
Spektrale Filterung
A
- Intensiät über Wellenlänge
- Anregungswellenlänge als vertikale Linie –> scharfe Linie (–> Rayleigh scattering + Reflexion)
- Fluoreszenzsoektrukm (redshifted), relativ breit
- Farbfilter, um Laserlicht und Fluoreszenz zu trennen
- Transmissionsband des Filters (lässt Anregungswellenlänge nicht durch)
21
Q
Zeitliche Filterung
A
- Intensität über der Zeit
- scharfe Laserlinie (kurzer Laserpuls)
- exponentieller Abfall der Floureszenz nach steilem Anstieg nahe des Laserpulses
- Detektionszeitfenster muss in ps ein und ausgeschaltert werden
- Größenordnung Fluoreszenz: ns –> größere Herausforderung als spektrale FIlterung
- schnelle Elektronik benötigt –> bei kruzer Verzögerung würde bereits ein Teil des Signals verloren gehen
- alle Streuungen können gefiltert werden (auch Raman), und Reflektion
22
Q
Hintergrund reduzieren
A
- Anregungswellenlänge –> Filter/ Absroption
- nutze die besten Filter
- gepulste Anregung (zeitliche Filterung)
- Detektoren mit geringer Dunkelzählrate (typisch: 100 Dark counts/sek)
23
Q
Was ist FRET? Welche physikalischen Prozesse stehen dahinter?
A
- Förster Resonance Energy Transfer
- für einen Energietransfer: zwei Fluorophore
- grün: wird zuerst angeregt –> Donor –> Absorption eines Laserphotons
- rot: Acceptor
- Distanz (2-3Angström) der beiden Chromophore entscheidet, ob Donor Energie an Acceptor übergibt–> wenn Distanz r gering genug –> Acceptor emittiert ein längerwelliges Photon (abhängigkeit mit 1/r^6)
- -> wenn kein Tranfer stattfindet –> Donor emittiert Photon: Strahlungsrate Donor: krd –> kompetitiver Prozess zum Energietransfer
- Pfeile: Nanoantenne (Nanodipol) –> Fluorophore haben Dipolcharakter –> Orientierung
- Energietransfer nur möglich bei Resonanz
- Emissionstransition des Donors hat die gleiche Frequenz wie die Absorption –> E = h*v bei beiden gleich
- Acceptor wird in ein Energiezustand angeregt, was über 1,0 ist (also ein Vibrationsniveau)
24
Q
FRET Transferrate - Parameter
A
- Fermis Goldene Regel verwenden
- T0: Fluoreszenz Lebenszeit (ohne Transfer) 1/T0 = krad+kisc+kic (alles außer Transfer) –> bei ro also Et = 50%
- r: Donor Akzeptor Distanz –> wollen wir wissen
- k^2: Orientierungsfaktor: neutual? Orientierung der Dono und Akzeptor Dipole
- n: Brechungsindex des Mediums (meist Wasser : n= 1,33)- Avogadrokonstante
25
Was ist das Überlappungsintegral?
- Repräsentation der Resonanz von FRET
- Fluoreszenzspektrum des Donors (links, da niedrigere Wellenlänge, grün)
- Absorbtionsspektrum des Akezeptors (rechts, rot)
- Überlappungsintegral dazwischen
- Donor- und Akzeptorspektrum multiplizieren und multiplizieren mit Wellenlänge^4
- Einheit der Spektren: Fluoreszenzspektrum normalisieren (=1) --> Wahrschienlichkeit für einen Transfer in diesem Bereich
- Absorptionsspektrum: µ^-1 cm^-1 (wellenlängeabhängige Auslöschungskoeffizienten des Akzeptors)
- Überlappungsbereich ist nicht der Bereich, wo die Spektren sich überlappen
- je größer der Überlapp, desto effizienter der Energietransfer
26
Förster Radius
- Distanz, wo Transfer Rate der Summe aller anderen Raten entspricht
- kt = 1/T0 * (ro/r)^6
- für r = r0 --> kt = krad + kisc + kic
27
Transfer Effizienz Et
- Rate der transferierten Quanten (output--> erfolgreich Transferprozesse) zu absorbierten Quanten (input)
- messbar:
- -> mittels Emission von Donor zu Akzeptor: Et = Emission A / (Emission D + Emission A) --> wenn Quantenausbeute nicht bekannt --> Ergebnis möglicherweise falsch
- -> mittels Fluoreszenzlebenszeit des Donors (transfer = zusätzlicheer Realaxations Kanal) : Et = 1 - TD,t/TD,0
- TD,t: mit Transfer (mit Akzeptor)
- TD,0: ohne Transfer (kein Akzeptor)
28
Was ist der Orientierungsfaktor?
- kappa^2 (k^2)
- Energie wird übertragen durch pure elektrostatische INteraktion (strahlungslos)
- osziellierend Dipol: Donoremissionsdipol --> oszillierendes elektrostatisches Feld --> typische Feldlinie Dipol
- für Transfer wichtig: der Akzeptor reagiert auf die Komponenten des oszillierenden Feldes des Donors parallel zum Akzeptor
- entlang der Achse des Pfeils können Ladungen sich bewegen --> hier kann Übertragung stattfinden
- wenn E-Feld Donor senkrecht zu E-Feld Akzeptor --> k^2 = 0 --> auch bei geringem Abstand --> kein Energietransfer
- wenn parallel: k^2 =1
- höchster Wert: beide in einer Reihe: k^2 = 4 (cos(0) =1)
- Formel: siehe skript (Winkel zwischen Vektoren und Dipolachsen: zwei Ebenen aufgepsannt --> Winekl zwischen den beiden Ebenen)
29
Transfer Effizienz - Distanzabhängigkeit von Donor und Akzeptor r
- Transfer Effizienz von 0 -1 aufgetragen über r
- Et = 1 / (1+(r/r0)^6)
- für r = r0 --> 1 / 1+1 = 1/2
- experimentell: Et wählen und zugehörige Distanz ermitteln (spektroskopisch) --> strukturelle Information
- Spektroskopisches Lineal (Kalibrationskurve)
- verschiedene Sensitivität bei verschiedenen Abständen --> Präzision am höchsten für den steilsten Anteil (nahe r0) --> hier fast lineare Beziehung zwischen Et und r --> limitierter Bereich, wo Lineal zu gebrauchen --> Bereich ist abhängig von Förster Radius
30
Warum sollten die Farbstoffe in einem FRET-Experiment frei rotieren können?
- wenn Dipole schneller rotieren als alle anderen Raten
- -> dann kann Durshcnittswert von k^2 = 2/3 genutzt werden --> gut, da Et dann nur von Abstand abhängt, da k^2 konstant
31
Wie unterschieden wir zwischen Orientierung und Abstand?
-
32
Rotatorische Mittelung
- flexible Befestigung --> freie Rotation
- dynamischer Mittelwert (Beide Dipole rotieren schneller als alle anderen Prozesse stattfinden) = 2/3 (t = konstant)
- ein Dipol rotiert schnell, der andere langsam: k^2 ungefähr 2/3
- statisches Ensemble --> langsame Rotation --> k^2 = 0,476 (nicht relevant für Single molecule, da wir hier nur eine Orientierung haben --> dies nur interessant für zufällige Oritentierungen mehrer Moleküle)
33
Wie kann man über eine Anisotropiemessung die freie Rotierbarkeit überprüfen?
- Anregunsgwelle mit linerar Polarisierung
- abhängig von der Polarisierung von Anregunsgwelle und Dipol --> verschiedenen Wahrsch. für Anregung
- Senkrecht: keine Anregung
- parallel: höchste Anregung
- in Küvette zufällig angeordnete Dipole --> selektive Anregung von molekülen --> moleküle emittieren Photonen, die ebenfalls best. Polarisation haben (parallel zur Dipolachse)
- zwischen Absorption und Emission: Floureszenzlebenszeit
- wenn Molekül rotiert zwischen zwei Anregungen --> emittiertes Photon hat eine andere Orientierung und Polarisierung als das absorbierte Licht --> Wechseln in Polarisierung des Fluoreszenzlichts --> Anisotropie r
- r gegeben durch die Polarisierung der versch. Richtung (vertikal und horizontal)
- steady state: r = Ivv - Ivh/ (Ivv + 2 Ivh) = Iparallel - I senkrecht/ (Iparallel + 2 I senkrecht) --> 2 wegen 2 Achsen --> zwei Relaxationsachsen
- r = 0 für freie Rotation --> beide Polarisationsachsen haben gleiche Wahrschienlichkeit bei freier Rotation
- bei keiner Rotation: Anisotropie
- -> r = r0 (r0: intrinscihe anisotropie. hier 0,4)
- vv: parallel zum Anregungslicht, vh: senkrecht zum Anregungslicht
34
Welchen Einfluss kann Photophysik (z.B. Triplett) auf FRET-Messungen haben?
- Donor im triplett: keine Absorption in den S1-Zustand --> kein Energietransfer --> keine Emission von Fluoreszenz--> Donor und Akzeptor dunkel
- Akzeptor im Triplett:
--> kein FRET --> Donor Fluoreszenz erhöht sich
oder:
--> Energietransfer von T1 zu TN --> Abhängig von der Effizienz dieses Transfer verglichen zum Standard FRET So-S1 --> Fluoreszenz des Donors kann steigen, sinken oder gleich bleiben
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Zeitaufgelöste Anisotropie
- prüfen, ob Bedingung k^2 = 2/3 erfüllt ist
- gepulste Anregung
- sonst Aufbau gleich wie bei Fluoreszenzanisotropie
- Pulsaduaer muss kleiner sein als alle anderen involvierten Prozesse sein (Größenordnung: < 100ps)
- exponentieller Zerfall
- t=0 --> r0 (intrinsische Anisotropie)
- bei festen Orientierungen : Konstante bei r0 (keine Rotation der Dipole)
Aufteilen in:
- schnelle Zerfallskomponente (~500ps: Zerfallszeitkonstante) --> schnelle Rotation der Farbe auf dem Protein
- langsame Zerfallskomponente (Zerfallskonstante: ~5ns) --> Rotation des gesamten Proteins
- T0: Rotatonskorrelationszeit: Verlust der Korrelationj über die Zeit
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Wie kann man erreichen, dass man Rotation der Farbe und des Proteins sehen kann?
- bei keiner Korrelation, würde man keine Rotation des Proteins sehen --> Korrelation zwischen Farbe und Protein nötig
- Verhältnis der Rotationszeiten messen (meist single labelled --> nur Donor oder Akzeptor)
Model: Rotation in einem Kegel
- Teff (schnelle Komponente) < Tfree (Rotaionskorrelationszeit der freien Farbe)
- es dauert länger, eine ganze Drehung des Proteins durchzuführen, als eine Drehung im Kegel
- d: Hindernis
- Oritentierung des Kegels ist fest zum Protein
- langsame Komponete Protein
Model: Vorübergehendes Kleben der Farbe auf dem Protein
- -> freie Rotation --> dann Kleben (abwechselnd)
- schnelle Komponente: Tf (Rotationskorrelationskomponente des freien Proteins)
- y: Zeit, wo Farbe und Protein nicht zusammenhängen
37
Photophysik
- Elektronkonfiguration wird nicht verändert im Fluorophor
- -> Triplett
- -> Dark state
38
Photochemie
- Elektron wird entfernt vom Fluorophor --> ionische Zustände (reversibel oder ireversibel)
- -> dark state
39
Singlet - Triplett Annihilation
- Absorptionsübergänge zu höheren Triplettzuständen im Akzeptor sind möglich --> kann durch angeregften Donor erreicht werden --> Donor übergibt Energie an angeregten Triplettzustand --> schnelle strahlunglose Relaxation im Akzeptor --> fällt auf T1
- sta von großem Abstand unterscheiden: Laserleistung erhöhen --> sta abhängig Laserleistung, Distanz nicht --> Veränderung im Signal deuten auf sta hin
40
Akzeptor im Triplettzustand
- 3 Fälle:
1. ) E-sta < Et Fluoreszenz erhöht sich, wenn Akzeptor im Triplett ist
2. ) E-sta = Et --> keine Veränderung des Donorsignal (Konstante) --> selten
3. ) E-sta > Et --> Donorsignal verringert sich mit Akzeptorsignal --> häufiger beobachtet
41
Wie kann man zwischen Et Veränderungen aufgrund von Abstandsänderungen und Et vs. E-sta unterscheiden?
- Zeitskala der tRIPLETTDYNAMIK IST ABHÄNGIG von Anregungsrate (Laserleistung)
- -> Dynamik ist beherrscht von Photophysik!
42
Welche prinzipielle Struktur haben synthetisch hergestellte Fluorophore? -Rhodamine
- Rhodamine: drei Ringsystem mit Sauerstoff im mittleren Ring und Ring mit verschiedenen Seitengruppen --> extraring ist geneigt im Vergleich zum Pi-Elektron-System in der 3-Ringstruktur
- -> konjugiertes Pi-Elektron-System --> abwechselnede Einzel- und Doppelbindungen
- -> Seitengruppen: Tunen des Systems --> Größer der Box kann sich ändern (siehe Quantengraben)
- -> hohe Quantenausbeute, Photostabilität, geringe ic-Rate
- Seitengruppen, die Löslichkeit in Wasser verbessern (SO3)
43
Elektronen, die in Absorbtion/Emission involviert sind
- delokalisierte Pi-Elektronen-Systeme
- linear oder Ring --> Benzolring
- die Elektronen können als frei bewegt im konjugierten System betrachtet werden --> Teilchen in einem Quatengraben / Box --> Energieniveaus werden durch Größe der Box gegeben --> Wellenfunktione der Elektronen werden durch stehende Wellen gegeben --> Abstände der Niveaus ist proportional zu 1/Länge der Box
44
Welche prinzipielle Struktur haben synthetisch hergestellte Fluorophore? - Cyanine
- konjugiertes Pi-Elektronen-System
- Kohelnstoffatome in Kette hinzufügen --> Länge des Quantengrasbens verändern --> Farbe der absorbierten Welle verändern (Wellenlänge) --> längere Kette --> längere Absorbtiosnwellenlänge (energieabstände sind keliner)
- hohe Quanten ausbeute Photostabilität, geringe ic-Rate
- ABER: Photoisomeriation --> führt zu Dark states
(Rotation um eine Einzelbindung: trans zu cis) trans ist fluoreszent, cis nicht
45
Welche Aminosäure wird typischerweise zur Kopplung von Fluorophoren genutzt?
- NH Koppeln (spezielle NH-Ester) --> kovalente Bindung
- unspezifisches Labeln (Seitengruppe oder terminal (diese ganz spezifisch gelabelt werden durch Einstellen des pH-Wertes) --> sonst eher stochastisch gelabelt
- -> SH Koppeln
- Cystein --> Protein verändern, dass Cysteinreste entstehen --> hier Färbung
- meist mit Maleimide --> Färbung mit Thioether gekoppelt an Protein
46
Shotgun-Labelling
- Gleichzeitg Donor und Akzeptor hinzufügen
- Problem: Donor-only-Molekül --> zeigen nur Donofluoreszenz Eapp = 0 --> nicht zu unterscheiden zwischen kein Akzeptor oder Akzeptor weit weg
47
Welche prinzipielle Möglichkeiten zur Immobilisierung von Proteinen gibt es?
- Gel-Immobilisierung
- Immobilisierung mit Liposomen
- Immobilisierung an Oberflächen
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Immobilisierte Proteine
+ lange Beobachtungszeiten --> Mehrer Übergänge beobachten
- Immobilisierung kann Artefakte schaffen
Konfokale oder Wide field(TIRF Detektion
49
Gel-Immobilisierung
- Proteine in eine Matrix
- Matrix formt Gel
- oft verwendet: agarose, PAA
- Gel (dessen Poren) sollte dicht genug sein, um Proteindiffusion vermeiden
+ kleine Moleküle können immer noch diffundieren
50
Immobilisierung in Liposomen
- Einfangen in kleinen Liposomen
- Doppelfettschicht
- innerhalb des Liposomens kann Protein diffundieren, aber nicht heraus --> Protein darf Laserfokus (zum Beispiel bei Konfikalmirkroskop) nicht entweichen
- chemische Milieu ist fest
- Immobilisierung der Membran Proteine --> zugang für kleine Liganden
- Biotin - Avidin - Biotin --> bindet dann an Doppelfettschicht, die auf Deckglas liegt
51
Was macht man bei einer Zustandsanalyse immobilisierter Moleküle, und was kann man daraus lernen?
- 2,3 oder mehr Zustände
- Photonrate (Intensität) über Zeit aufgetragen --> Transient trace
- -> Kriterien aufstellen:
- Schwellwerte definieren --> teilweise Übergänge erwarten bei einzelnem Schwellwert, wo keine sind --> mehr Schwellwerte nutzen mit mehrdeutiger Zone herum
- in dieser Zone kein klarer Zustand
- Änderung des zustands nur bei Durchgequeren dieser Zone
- -> Histogramm erstellen aus Werten unter- und oberhalb des Schwellwerts (verweilzeiten)
- -> Fitten mit 2 Gaußfunktionen, die Wahrschienlichkeit angeben, in welchem Zustand (on oder off)
- -> Raten definieren: koff (von on zu off) und analog kon (Dwelltime, wie lange in off oder on)
- besonders kurze Verweilzustände könne übersehen werden --> hidden states
52
Immobilisierung an Oberflächen
- His-Tag, Strep-Tag
--> His-Tag-Protein bindet an bespw. Nickel --> andere nicht --> einzelnes Protein --> lässt sich wieder lösen
- Nickel bindet an Si-Gruppe und diese an Deckglas
- Strep-Tag: Biotin-gelabelte PEG oder BSA
+ zugänglich für kleine Liganden
- Artefakte
53
Photobleaching
- hohe Laserintensität --> Ausbleichen der Färbungsmoleküle
- Ein-Schritt-Prozess bei Single-Molecule
- Akezeptor ausgeblichen --> Donor könntenoch zu sehen sein
- beide ausgeblcihen: Moelkül ist dunkel! --> dann nächstes Protein untersuchen
54
Was ist eine Korrelationsanalyse, und welche Information liefert diese bei immobilisierten bzw. frei diffundierenden Molekülen?
- bei niedriger SNR --> Zustandsanalyse hier nicht möglich
- zeitliche Korrelationen: systematische Fluktuationen in einem verrauschten Signal
- Korrelationsfunktion zwischen zwei Signalen
- sind diese identisch --> Autokorrelation
- umso größer Verschiebung, desto geringer Korrelation
- -> sonst: Cross-Korrelation
- Korrelationszeit T: Zeit, um die ein Signal verschoben wird
- Zähler: Multiplizieren dann integrieren (Durschnitt) (ein Signal um T verschoben)
- Nenner: erst intergireren dann multiplizieren (ohne T)
- Korrelationsfunktion über T aufgetragen
- T erhöhen --> Zähler (Linie im Graph sinkt)
- für lange Zeiten --> Koorelationsfunktion nähert sich 1 an und Zähler nähert sich Nenner an
- Korrelationsfunktion kann mit exponentiellem Zerfall beschrieben werden
Korrelationsanalysen:
Fluorescence Correlation Spectroscopy: Informationen über Diffusionszeit und darüber über Molekülgröße, Bindung/ keine Bindung an anderes Molekül
55
Dwell-Times
- Verweilzeiten im on- bzw off- Zustand
- im Histogramm plotten (nicht einfach Durschnitt bestimmen)
- off-dwell-time über Auftreten
- exponentiell --> 1st Order Kinetik
- -> Analog für on-time
- kon = 1/Toff, koff = 1/Ton (T: durschnittliche Verweilzeit in jeweiligem Zustand)
56
Hidden Markov Modelling
- hidden states: Zustände, die sich in ihrer FRET Effizienz nicht unterscheiden (exponentieller Anstieg gefolgt von exponentiellem Zerfall)
- ebenfalls Übergangswahrschienlichkeit von Zustand zu sich selbst --> sagt etwas über Lebensdauer aus
- Donor und Akezeptor als "Emissionen"
- Emissionswahrschienlichkeiten von versch. Zuständen werden angegeben
- Übergangswahrscheinlichkeiten
- FRET EInschränkung: A+D= const.
- BIC: Anzahl der Zustände ermitteln --> sollte nicht überdeterminiert sein --> BIC = 0 bei guten Modell
- generelle Strategie: Erhöhen der Komplexität des Models führt zu einem besseren Fit, aber wenn es keine signifikaten Verbesserungen der Übereinstimmung zwischen Modell und Ergebnis sind --> Komplexität nicht weiter erhöhen
57
Was ist eine Burstanalyse, und welche Information liefert diese bei frei diffundierenden Molekülen?
- Photonanzahl über Zeit aufgetragen
- Molekül in Laserfokus --> Fluoreszenz --> Burst im Spektrum, wenn gewisser Schwellwert überschritten
- unterschieden in Donor und Akzeptor
- FRET Effizienz kann ermittelt werden durch Donor und Akzeptorintensität für einen Burst
- Akzeptor: 100 Photonen, Donor: 50 --> Et = 100/(100+50) = 0,66
58
Vergleich Korrelation mit Zustandsmodell
- Korrelation benötigt keine Schwellwerte
| - Korrelation benötigt ein Modell, welches ermittelt werden muss (zum Beispiel: 2 Zustandsmodell)
59
Experimente in Lösung
- freie Diffusion und konfokale Detektion: jedes Molekül ist nur eine kurze Zeit sichtbar
- interne Dynamiken sind nur in limitierten Zeitfenstern zugänglich -
- nahe physiologische Bedingungen +
- einfach + (starten, warten, Daten sammeln)
- Brownsche Molekülbewegung --> zufällig --> Molekül gelangen vielleicht in den Laserfokus und fluoreszieren
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Burst-Werte in Histogramm
- Histogramm über Fluoreszenzparameter jedes bursts
- Auftreten über FRET Effizienz aufgetragen
- Annahme: unterscheidbare Zustände mit verschiedenen FRET Effizienzen
- Rauschen führt zu Verbreiterung des Spektrum
- Vorgehen: einfachstes Modell --> 1 Zustand -->1 Gauß --> Komplexität erhöhen --> weitere Gauß hinzufügen --> Qualität des Fits: x^2: gewichtete Summe der quadrierten Modellabweichungen
- versch. Zustände mit versch. Fluoreszenzparametern --> mehr Gauß-Pekas
- -> wenn ein Zustand sich ändert. während er im Fokus ist, gehen die Peaks ineinander über
- -> wenn sich Zustand zu schnell ändert, sieht man nur noch Mittelung der Peaks
- -> intermediate: stat exchange ~ focal transit --> genau Eine Zustandsänderung
- Integral bzw. Peakhöhe gibt an. wie Zustand besetzt ist
- Breite der Peaks mit Rauschen vergleichen
61
Fluoreszenz - Korrelationsspektroskopie
- Diffusionsdynamiken führen zu Fluoreszenzfluktuationen
- Diffusion ist ein fraktiler Prozess --> ähnlich auf allen Länbge und Zeitskalen (großes Spektrum an Zeitskalen)
- log Zeitskala der Korrelationszeitachse --> Esponentialfunktion
- N: Anzahl der Moelküle im Fokus --> 1/N: Amplitude
- TD: KOrrelationszeit
- Signal ist prop zu N
- Standardabweichung von N = 1
- N = c*VFokus
- je höher die Konzentration, desto geringer die Amplitude der Funktion
- D: Diffusionsgeschw. (Diffusionskosntante prop. 1/r) --> sagt etwas über größe des Moleküls aus
- Verschiebung der Kurve nach rechts wegen Bindungspartner
- alle Prozesse, die schneller als Diffusion sind (FRET, Triplett, interne Dynamiken) bleiben sichtbar
- DD und AA Autokorrelation (über Diffusionsfunktion), AD Crosskorrelation (unter Diffusionfubktion)
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Was ist das generelle Ziel bei Multiparameterdetektion?
- FRET Data verlässlicher machen --> Missinterpretationen vermeiden --> strukturelle Informationen von Photophysischen Prozessen unterscheiden
63
Gibt es einen Unterschied zwischen den Crosskorrealltionsfunktion gad und gda?
- 2-Zustands-Modell: kein Unterschied zwischen den Funktionen
- 3-Zustands-Modell: gerichtet (geordneter Mechanismus), verschiedene FRET-Eff. --> Funktionen unterscheiden sich
- wenn Bleaching auftritt: Veränderung der Anregungsrate führt zu Änderungen in den Raten (Photophysik), aber nicht die Raten in einem 3-Zustands-Modell, da dies Proteindynamiken sind
64
Wichtige Fluoreszenz-Parameter bei FRET
- Photonendichte (fluss/Intensität)
- Fluoreszenzlebensdauer
- Anisotropie
- Emissionsspektrum
- Anregungsspektrum
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Intensitäs-FRET
- Kombination der FRET-Effizienz und der Gesamtintensität
- Ez = Photonen A / (Photonen A + Photonen D) --> stimmt nur wenn QY = 100% (und wir alle Emissionen detektieren können)
- -> andernfalls muss die Gleichung korrigiert werden mit der Detektiosneffizienz
- Y: QY*Detektionseffizienz
- -> verschieden Ys für DOnor und Akzeptor: Integral der Intensitä hängt von Et ab --> höhere Et führt zu einer niedrigeren zahl detektierter Photonen --> Ya < Yd --> korrigieren --> Populationen der Ausbeuten sind gleich
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Detektionseffizienz:
- Gerätabhängig
- Kollektionseffizienz (Mikroskoobjektiv) ~ 30%
- Filterübergangkurven
- Spektrale Ausbeute des Detektors (welche Wellenlängen können aufgenommen werden)
- -> meist < 10%
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Wie kann man die Markierungs-Stöchiometrie am einzelnen Molekül bestimmen?
- Stochastisches Labeln: DD und AA Proteine
- selektive, wechselnde Anregung von A und D mit zwei Lasern (ALEX = Alternating Laser Excitation) oder PIE (Pulsed Interleaved Excitation)
- Definition einer neuen Größe: Stöchiometrie S
- S = Ftot, Dexc / (Ftot, Dexc + Ftot, Aexc)
- gesamtes Signal wird gemessen
- Ftot = Summe Donor und Akzeptor Signal
- Donor only: Ftot, Dexc = 1, Ftot, Aexc = 0 --> S = 1
- Acceptor only: Ftot, Aexc = 0, Ftot, Dexc = 1 --> S = 0
- D + A --> Ftot, Dexc = 1, Ftot, Aexc = 1 --> S = 1/2
- schwer zu unterscheiden zwischen D only oder großem Abstand
- A only selten zu sehen, da direkte Akzeptr Anregung nicht im eigentlich Experiment; außerdem bei AA keine Energieübertragung
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Lebenszeit und Intensität
- ratiometrische Et (sensitiv gegenüber Akzeptor QY)
Et = Photonen A / ( Photonen A + Photonen D)
--> Eine Veränderung in Donor QY ist äquivalent zu einer Reduktion der Anregungsrate
- Donor Lebenszeit Et (sesitiv gegenüber Donor QY)
Et = 1 - Td,t/Td,0
--> Td,t: Lebenszeit Donor mit Akzeptor (mit FRET), Td,0: Lebensdauer Donor ohne Akzeptor
- Donor quenching führt zu Reduktion der Lebensdauer
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Anisotropie und Lebensdauer
- Anisotropie ist wichtig zu messen, um mögliche Veränderung in der Rotation festzustellen
- Perrin Gleichung verbindet Anisotropie und Lebensdauer
- je kürzer die Zeit zw. Abs und Em., desto höher die Anisotropie (wenigewr möglichkeit, zu rotieren)
- rD = r0 / (1 + Tf/Orot)
- Orot: Rotationskorrelationszeiot
- FRET reduziert Fluoreszenz-Lebensdauer --> erhöht die Fluoreszenz Anisotropie
- Rotatinale Verhindetrung kann sichtbar werden
- kurze Donor-Lebesndauer bedeutetr eine geringe Anzahl von Donorphotonen
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Ideales multiparameter FRET- Experiment
- gepulster Donor-Laser --> Donorlebensdauer ermitteln--> 2 Detektoren für den Donor --> Anisotropie des Donors ermitteln
- gepulster Akzeptor-Laser --> 2 Detektoren für Akzeptoren --> Anisotropie des Akzeptor messen (sollte niedrig sein, Akzeptorlebensdauer sollte konstant sein)
- -> führen zusammen zu Stöchiometrie
- Kombination aller Detektoren --> Gesamtintensität --> Korrektionsfaktor Y ermitteln
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Triplett-Modifikation
| Was ist Triplet-Quenching, und wie kann Sauerstoff dieses bewirken?
-Es wäre vorteilhaft, die Rate der Intersystem-Kreuzung zu reduzieren und die Rate der umgekehrten Intersystem-Kreuzung zu erhöhen, letzteres als Triplett-Löschung bezeichnet
-Schwere Atome wie Iod erhöhen beide Raten, indem sie die Spinumkehr durch Spin-Bahn-Kopplung erleichtern
-Reduktion des Intersystem-Crossings würde eine Reduktion der Spin-Bahn-Kopplung voraussetzen, was meist nicht möglich ist - es bleibt beim Triplett-Quenching, das durch Austausch eines Elektronen des reversen Spins mit einem anderen Molekül möglich ist
-Zwei Bedingungen müssen für diesen Vorgang erfüllt sein:-Es muss ein Kontakt zwischen dem Fluorophor und dem Triplett-Quencher bestehen-die Regel der Energieerhaltung muss erfüllt sein, d.h. die Energiedifferenz zwischen T1 und S0 des Fluorophors muss mit derjenigen der entsprechenden Zustände im Quencher übereinstimmen
-Vielfacher Triplett-Löscher ist Sauerstoff, der einen stabilen Triplett-Zustand hat --> Sauerstoff tauscht mit Fluorophor Elektron aus --> antiparalle Spins --> wieder in Singulett
Triplett-Löschung durch Sauerstoff erzeugt hochreaktiven Singulett-Sauerstoff
- Singlett Sauerstoff kann zu Photbelaching führen
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Radikal-ionische Zustände
Diese radikal-ionischen Zustände sind typischerweise das Ergebnis eines Zwei-Photonen-Absorptionsprozesses: Das erste Photon bringt das Fluorophor in einen angeregten Zustand, das zweite ionisiert das Fluorophor von dort aus
-Um diese dunklen Zustände zu verkürzen, kann ein reduzierendes/oxidierendes System (ROXS) eingesetzt werden, das nur eine Mischung aus einem oxidierenden und einem reduzierenden Mittel ist
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Was sind die wesentlichen Unterschiede zwischen den verschiedenen, in der Einzelmolekülspektroskopie eingesetzten Mikroskopiemethoden?
- Wide field
- TIRF (prisma oder Objektiv)
- Konfokale Mikroskopie
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Epi Fluoreszenz-Mikroskop
- Basics
- Anregung und Emission durch das gleiche Mikroskopobjektiv
- -> werden mit dichroitischem Strahlteiler aufgeteilt --> Fluoreszenz ist wird durchgelassen, Anregung reflektiert
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Wide Field Mirkoskopie
- ganz Probe beleuchtet mit parallelem Licht
- Fluoreszenzdetektion mt Kamera (2D-Detektor)
- Köhler Beleuchtung nicht notwendig, da Fluoreszenz isotropisch ist
- Nachteil: 3D Probe, aber 2D Detektor --> Moleküle die in dieser Brennebene liegen, sind scharf --> anderes außerhalb dieser Ebene--> Hintergrundrauschen, da Fluoreszenz-licht trotzdem detektiert wird, da ganze Probe beleuchtet wird
- Laser wird in Brennebene hinter Mikroskopobjektivs fokussiert
- + Paralle Detektion vieler Moleküle
- + ms Verfolgung möglich
- - außerhalb Fokus angeregte Moleküle sorgen für Hintergrund-Fluoreszenz
- - gemacht für dünne Film-Proben, zum Beispiel Membrane oder immobilisierte Moleküle
- - Zeiauflösung durch Kamera begrenzt (ms - 100 µs)
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TIRF
- 2D Beleuchtung mit Laser
- totale interne Reflektion (Fluoreszenz)
-Licht an einer Grenzfläche von einem Medium mit höherem Brechungsindex zu einem Medium mit niedrigerem Brechungsindex einfällt, wird es bei einem Einfallswinkel oberhalb des kritischen Winkels acrit=sin(nlow/nhigh), wird es total reflektiert
Die Maxwell-Gleichungen führen jedoch zu einer an der Oberfläche gebundenen Welle, die entlang der Grenzfläche mit einer Feldamplitude verläuft, die exponentiell in das Medium mit dem niedrigen Brechungsindex (z-Koordinate) abfällt:
I(z)=I0e^-z/d (Evaneszentes Feld)
- d: Eindringtiefe abhängig von Winkel und Wellenlänge und Brechungsindex
- Fluoreszenzdetektion mit Kamera
+ Beleuchtung einer dünnen Schicht --> Moleküle oberhalb nicht angeregt
+ paralle Detektion
- keine Auflösungstiefe
- Kameralimitationen
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Dipolemission an Oberflächen
- Orietierung des Dipols zur Oberfläche verändert EMission
| - Senkrecht --> Licht geht in best. Richtung (das meiste im kritischen Winkel --> ins Glas!; wenig ins Wasser)
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Prisma TIRF
- totale interne Reflektion an Oberfläche über Objektiv
Hier wird, wie der Name schon sagt, die Probe über ein Prisma beleuchtet (Hinweis: Fluoreszenz)
-Fluoreszenz wird von der anderen Seite durch das Wasser detektiert (Wasserimmersionsobejektiv!)
-Vorteile
-Kein Dichroit notwendig
-Beliebiger Einfallswinkel realisierbar: sehr flexibel
-Nachteile
-Emission wird von der "falschen" Seite detektiert und reduziert das Signal
-Schlechte Zugänglichkeit der Probe
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Objektiv-TIRF
- Der Emissionslaser wird in einem Epifluoreszenzschema in der hinteren Ebene des Mikroskopobjektivs ganz am Rand der Apertur fokussiert
- Kollimiertes (paralleles) Licht verlässt das Objektiv unter einem Winkel, der durch die numerische Apertur des Ölimmersionsobjektivs begrenzt ist
+ kein Strahlteiler nötig
80
Konfokale Mikroskopie
-Bei einem konfokalen Mikroskop gibt es eine Punktbeleuchtung und eine Punktdetektion, wobei der Beleuchtungspunkt und der Detektionspunkt auf einen Punkt in der Probe fokussiert sind, daher der Begriff konfokal
-Der Hauptvorteil ist eine enorme Reduzierung des Hintergrundsignals.
-Der Hauptnachteil ist, dass keine parallele Detektion mehr möglich ist
-Zur Bildgebung muss der konfokale Punkt in Bezug auf die Probe abgetastet werden
-Zu diesem Zweck muss entweder der konfokale Punkt (Laserscanning) oder die Probe (Proben- oder Tischscanning) bewegt werden
Der Vorteil des Laserscannings ist, dass der Abbildungsbereich durch die Wahl der geeigneten Mikroskopobjektivvergrößerung verändert werden kann.
-Auch sperrige Probenkammern können verwendet werden
-Typischerweise sind auch höhere Scangeschwindigkeiten erzielbar
-Hauptnachteil des Laserscannings ist, dass das Mikroskopobjektiv einen Winkel zwischen dem Lichtdurchgang und der optischen Achse bildet, was zu optischen Aberrationen führt
Beim Stage-Scanning hingegen ist der Lichtdurchgang immer parallel zur optischen Achse
-Hier ist das Sichtfeld jedoch durch den Scanbereich des Scanningtisches begrenzt, der typischerweise 100μm in x und y 47 beträgt.
-Zudem können sperrige Probenkammern wie Kryostate nicht mit dem Tischscanner bewegt werden
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Welche Anforderungen sind an Lichtdetektoren für Einzelmolekülfluoreszenz zu stellen?
- generelles Prinzip: Generiren einer Ladung durch ein Photon
- hohe Quanteneffizienz (Ladung pro Photon) über einen breiten Wellenlängenbereich
- hohe Linearität (keine Sättigung)
- hohe Zeitauflösung
- niedrige Dunkelzählrate
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Lichtquelle
- cw oder gepulster Laser
- Pulsdauer: ~ 100 ps
- Repititionsrate: 10-100 MHz
- schnelle geschaltet Laser (µs) --> ALEX
83
Halbleiterlaser
- Wellenlänge 400 - 14000 nm
- einzige Wellenlänge (leicht abstimmbar)
- Cw und gepulst (100 ps, flexible Pulsraten)
- elliptisches Strahlprofil
- guter Wirkungsgrad (230 Volt, Luftkühlung)
- kompakt
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Gas (Ionen) Laser
Wellenlänge 325 - 676 nm
- mehrere Linien aus einem Laser-Cw und mode locked
- exzellentes Strahlprofil (effiziente Faserkopplung)
- niedriger Wirkungsgrad
- (kW Leistungsaufnahme, Wasserkühlung)
- dick
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Festkörperlaser
λ = 266 - 1444 nm
- eine Linie
- Cw und modengekoppelt (bis zu fs Pulsdauer)
- exzellentes Strahlprofil (effiziente Faserkopplung)
- Diodenlaser gepumpt: hohe Effizienz, kompakt
- Faserlaser: sehr kompakt, widerstandsfähig
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Supercontinuum-LAser
Quasi-Kontinuum 400 - 2000 nm
- Wahl der Wellenlänge mit Filter oder Gitter
- nur gepulst (ps)
- Günstiges Strahlprofil
- hoher Wirkungsgrad
- eher kompakt
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Filter - Ansprüche
- Transmission (so hoch wie möglich, nahe 1)
- Flankensteilheit (möglichst steil, T=0,1 bis T=0,9 innerhalb weniger nm)
- Optische Dichte im Sperrbereich (>5, d.h. 105 Unterdrückung)
- Polarisationsabhängigkeit (so klein wie möglich)
88
APD
```
+ Einzelphotonen-Detektion
+ gute Linearität
+ gute Quanteneffizienz (>60% im roten Bereich)
+ vernünftige Zeitauflösung (400 ps)
- Nachpulsieren
- hohe Dunkelzählrate
```
89
PMT
```
+ Einzelphotonen-Detektion
+ hohe Zeitauflösung
+ große Detektorfläche - schlechte Linearität
- kleiner Spektralbereich
- geringe Quanteneffizienz (<25%)
```
90
CCD Kamera
- Ladungsgekoppeltes Bauelement (Nobelpreis Physik 2009)
- Ladungen werden in Pixel akkumuliert (maximale Anzahl [volle Well-Kapazität] bestimmt Dynamikbereich)
- Ladungen werden "gezählt", typ. Rauschen 4-5 Ladungen (!)
- Quantumseffizienz erreicht 100 %.
91
EMCCD Kamera
- Elektronenmultiplikator Ladungsgekoppelter Baustein
- Ladungen werden wie in CCD akkumuliert
- Spezieller Bereich auf dem Chip (Gain-Register) dient der Verstärkung durch Erzeugung von Sekundärladungen mittels Hochspannung
- aber: diese Verstärkung führt Multiplikationsrauschen ein
- Einzelphotonen-Detektion möglich
- Quantum-Effizienz nahe 100 %
- dunkles Rauschen - durch Kühlung (-90 °C) auf 0,001/Pixel/s reduziert
- Ausleserauschen - durch Verstärkung nicht relevant (0,02 Ladungen effektiv)
92
CMOS Kamera
- Ladungs-Digital-Wandlung innerhalb eines Pixels
- Verbesserte Geschwindigkeit, geringeres Ausleserauschen
- Höheres Pixel-zu-Pixel-Rauschen
93
Was ist Triplet-Quenching, und wie kann Sauerstoff dieses bewirken?
Idealer Fluorophor hat keinen Tripletzustand, man möchte kurze Tripletzustände und geringe Triplett-yield = niedrige Wahrscheinlichkeit in Triplett zu gehen
Tripletquencher helfen den Tripletzustand zu verkürzen/verhindern
Triplettzustände werden kürzer
Tripletquencher, Schwere Atome: tauscht Elektron aus, Fluorphor und Quencher gehen beide in Excited state, durch Elektronentausch (dann Spin anders/passend einer nach oben, einer nach unten) , Bedingungen:
• Energiematching notwendig von den Quencher und Fluorophoren
• Wavefunction müssen Überlappen, schmaler Abstand: bedeutet Van der Waals Kontakt
Sauerstoff: normalerweise, stabil in Triplett
Austausch eines Elektrons mit Fluorophor: Singlet Sauerstoff instabil, hochreaktiv mitn triplett fluorophor und dadurch Singlet Fluorophor
Mit Sauerstoff Tripletquenching effektiv, Problem: ist hohe Reaktivität, die zu Photobleaching vom Fluorophor führen kann, Vorteil: erhöhen fluoreszenz durch triplettquenching
