Proteinbiophysik Flashcards

Question

Welche Abhängigkeit besteht zwischen dem mittleren End-zu-End Abstand und der Zahl der Segmente sowie der Segmentlänge beim random coil?

Answer 1

- Um den Absolutwert der mittleren End-to-End-Distanz zu bestimmen, behandeln wir: = < Sum(i=1 -N)ri * sum(j=1) rj> = -Diese Doppelsumme kann umorganisiert werden: in Terme mit i=j (einfache Summierung) und solche mit i ungleich j: (Beides dann noch addieren) - die Summanden der ersten Summe ergeben: r*r=betrag(r)^2 = l^2 -Die Skalarprodukte in der zweiten Doppelsumme können positiv oder negativ sein. Aufgrund der zufälligen Orientierungen gibt es immer Paare von Skalarprodukten, die sich aufheben, so dass die zweite Doppelsumme gleich Null ist --> Betrag(R^2) = N*l^2 - die Wurzel ist die root mean square Distanz : Rrms = Wurzel() -Im Modell der wurmförmigen Kette (WLC) sind benachbarte Monomere in ihren relativen Orientierungen eingeschränkt, so dass die Orientierung auf einer Längenskala, der sogenannten Persistenzlänge, korreliert bleibt. -Wenn die Kette jedoch lang genug ist, verhält sie sich wie eine FJC mit einer effektiven Monomerlänge leff.

Answer 2

Ein Lösungsmittel wird als Theta-Lösungsmittel (oder auch θ-Lösungsmittel) bezeichnet, wenn sich ein in ihm gelöstes Polymer wie eine ideale Kette verhält. Es gilt: Rrms = sqrt(N)*l sqrt(N) = n^(1/2) wenn mehr abstoßende Kräfte: Exponent größer 0.5 wenn mehr anziehende Kräfte: Exponent kleiner 0.5 Polymere in Theta-Lösungsmitteln zeigen, ebenso wie Polymere in der Schmelze, ein d-dimensionales Random-Walk-Verhalten, wobei d die Dimensionalität des betrachteten Polymers ist.

Answer 3

Bisher haben wir nur den Durchschnitt der Ende-zu-Ende-Distanz RRMS behandelt. - Es gibt jedoch eine Reihe von Problemen, bei denen es wichtig ist, die Wahrscheinlichkeit für einen bestimmten Ende-zu-Ende-Abstand zu kennen - Der Einfachheit halber behandeln wir nur eine Kette mit Monomeren, die entweder nach rechts oder nach links zeigen - Der End-zu-End-Abstand ist einfach die Differenz zwischen rechts- und linksgerichteten Monomeren, multipliziert mit der Monomerlänge - Wahrscheinlichkeit für einen bestimmten Abstand ist also gegeben durch die Wahrscheinlichkeit, dass von N Monomeren k Monomere nach rechts zeigen - Dies entspricht der Anzahl der Erfolge (z. B. richtige Monomere) in einer Stichprobe der Größe k, die mit Ersatz aus einer Grundgesamtheit der Größe N gezogen wird, was zur Binomialverteilung führt - Die Wahrscheinlichkeit für den Erfolg ist in diesem Fall 1/2 - Die höchste Wahrscheinlichkeit in diesem Fall ist für gleiche Anzahlen von rechten und linken Monomeren, was einem Ende-zu-Ende-Abstand von Null entspricht - Für große N und k kann die Binomialverteilung durch die Normalverteilung (oder Gauß-Verteilung) angenähert werden - Abweichungen eher am Rand der Binomilaverteilung - Dies führt zur Wahrscheinlichkeitsdichte eines Ende-zu-Ende-Abstandes R einer Kette, die aus N Monomeren der Länge l besteht: - PN(R) = 1/(sqrt(1/(2pi*N*l^2)))*exp(-2R^2/(Nl^2) dR - Das dR zeigt an, dass PN eine Wahrscheinlichkeitsdichte ist: das Integral über PN muss die Eins ergeben, der Faktor 1/(sqrt(1/(2pi*N*l^2)) - der Teil vor der emp-Funktion ist für Normalisierung - Gibss Free Energie kann als Funktion des End-zu-End ABstands angegeben werden --> bei R = 0 --> Prabel passt perfekt, bei größeren Abständen --> Abweichungen von Gauß zu Binomial

Answer 4

- Erklärung für Kooperativität (beeinflussung von helix und coil) - helix: native, coil: ungefaltet -In dieser Theorie kann jede Aminosäure drei Energiezustände annehmen: -AA als Spirale -AA als Helix -AA als Helix mit dem benachbarten AA als Coil -Es gibt drei Boltzmann-Gewichte, die diesen Energien entsprechen: -Spirale: Gewicht 1 (gemäß G= -kTln(Q) entsprechend dem Energie-Nullpunkt) -Helix: Gewicht s -Helix mit benachbarter Spule: sigma*s - Partitionsfunktion Q = sum(i,j) wi,j*s^1i*sigma^j mit i der Anzahl der helikalen Reste und j der Anzahl der helikalen Abschnitte (jeder helikale Abschnitt hat einen Helix-Spiral-Übergang an seinem Ende) und wij der Anzahl der möglichen Kombinationen von i bzw. j -Der Helixanteil als Funktion der Helixdehnungsparameter für verschiedene Werte des Helixinitiationsparameters sigma zeigt die Änderung der Kooperativität durch die Änderung von sigma -Je höher die Energiekosten für eine Helix-Spiral-Grenze sind, desto kooperativer ist der Übergang -Solche Energiekosten ergeben sich aus dem Gleichgewicht zwischen Reduktion der Konformationsfreiheit einerseits und der Ausbildung von Wasserstoffbrückenbindungen in der Helix andererseits: -Ein AA, das einer Helix-Strecke benachbart ist, ist bereits in seiner Konformationsfreiheit eingeschränkt, so dass die weitere Einschränkung durch die Ausbildung der Wasserstoffbrückenbindungen weniger Energie kostet als die Ausbildung dieser Bindung liefert --In diesem Sinne führt die Helix-Spiral-Theorie zu einer Art Reißverschluss-Modell für die Proteinfaltung, das nicht alle Aspekte der Proteinfaltung widerspiegelt - Helixbruch = 0,5 bei s =1 --> Boltzmanngewichte von helix und coil sind gleich --> größte Anzahl möglicher Ausführungen --> geringste Energie für gleiche Anzahl - am Ursprung: alle Coil, mit s gegen unendlich: alle Reste sind Helix

Answer 5

- wichtig für Kraft-Faltung/Entfaltung und Sehnenelastizität - Kraft über Potential verbunden: F = -dV/dx - hier ist x = R - G als Fkt. von R: G = -kT ln(Q(R)) - Die Partitionsfunktion Q(R) kann mit der Wahrscheinlichkeitsdichte eines bestimmten End-zu-End-Abstands identifiziert werden - Diese Gaußsche Näherung gilt am besten für moderate Dehnungen (immer noch nahe an der Gaußschen Kette!): - G(R) = -kT(-2R^2/(Nl^2) + ln (1/(sqrt(1/(2pi*Nl^2))))) - -> harmonische Potential - -> damit Kraft berechenen: F(R) = -4kT R/Nl^2 (Hooksches Gesetzt: F(R) = -DR) mit der Kraftkonstante D = 4kT/Nl^2 - -> prop. zur Temp --> je höher die Temp., desto steifer die Feder --> gitl nur für Normalverteilung, nicht für binomiale - -Bei vollständiger Streckung (Abstand von Ende zu Ende gleich der Konturlänge) wird die Kraft extrem hoch --> hier Modell nicht mehr gut zu nutzen

Answer 6

-Die Wahrscheinlichkeit eines Kettenteils, eine Schleife zu bilden, ist von Bedeutung für die Proteinfaltung: -Es wird angenommen, dass die Bildung von frühen Kontakten ein primäres Ereignis bei der Proteinfaltung ist -Die Wahrscheinlichkeit der Schleifenbildung entspricht der Wahrscheinlichkeit, dass sich die Enden eines Kettenteils (zur Bildung einer Schleife) innerhalb eines endlichen Volumens befinden, was der Proportionalität folgt: PN,loop prop. (2pi*Nl^2)^(-3/2)

Answer 7

- Bei nicht idealen Ketten bestehen weitreichende Wechselwirkungen zwischen nicht benachbarten Monomeren - Wenn diese Wechselwirkungen attraktiv sind, ist die Kette kompakter als eine ideale Kette, wenn sie abstoßend sind, ist die Kette weniger kompakt - Bei solchen Ketten ist der RMS-Abstand von Ende zu Ende nicht proportional zur Quadratwurzel aus der Anzahl der Monomere: Rrms prop N^v - -Der Exponent v ist größer als 1/2 für abstoßende und kleiner als 1/2 für anziehende Wechselwirkungen - Durch die Wahl eines geeigneten Lösungsmittels können anziehende und abstoßende Kräfte ausgeglichen werden, was zu v=1/2 führt. - Ein Lösungsmittel, das die Kräfte ausgleicht, die zuv=1/2 führen, wird Theta-Lösungsmittel (✓Lösungsmittel) genannt

Answer 8

-Hier soll der Entropiegewinn bei der Entfaltung eines strukturierten Proteins zu einem random coil grob abgeschätzt werden -Wir werden die folgenden Annahmen treffen: Eine Einfachbindung erlaubt drei Orientierungen (sp^3-Hybridisierung) -Zwei solcher Bindungen im Rückgrat (die Peptidbindung selbst ist planar), in den Seitenketten im Durchschnitt drei Einzelbindungen -Wir haben für die entfaltete Kette: Q = 2^3*3^3 = 216 - mit S = R ln (Q) --> 44 JK^-1mol^-1 pro Rest -In einem kooperativen Prozess muss dieser Wert einfach mit der Anzahl der Reste multipliziert werden -Wenn wir weiter vereinfachend davon ausgehen, dass es nur eine native Konformation gibt (Q=1 und damit Snative=0), ist dies der Entropiegewinn durch Entfaltung -Experimentell gefunden ist etwa die Hälfte dieses Wertes, da einerseits auch im nativen Zustand eine gewisse konformationelle Flexibilität vorliegt und andererseits auch im entfalteten Zustand eine gewisse Struktur vorhanden ist (Senkung von Q)

Answer 9

- Temperatur - Druck - Denaturantkonzentration - Kraft

Answer 10

- dfG = dfH - T*dfS - Wir können die Änderungen der Enthalpie bzw. Entropie in einen Anteil, der zum Protein gehört, und in einen Anteil, der zum Lösungsmittel (hauptsächlich Wasser) gehört, aufteilen - HProt,N << HProt, U --> Bildung nichtkovalenter Bindungen - HH20,N > HH20,U --> im gefalteten Protein werden H-Bindungen zum Protein hingebildet --> fehlen im wasser - -TSProt,N >> -TSProt, U --> mehr Mikrozustände (mehr Freiheiten) im ungefalteten Zustand - -TSH20, N < -TSH20, U --> hydrophobischer Effekt --> H20-Moleküle haben mehr Freiheiten an hydrophilen Oberflächen - Zu Beginn der Faltungsreaktion gleicht die leichte Abnahme der Gibb'schen freien Energie aufgrund der letzten Zeile (hydrophober Effekt) die beiden positiven Beiträge aus. - Während wir oben die Energiedifferenzen zwischen den beiden Zuständen behandelt haben, ist ein anderer Ansatz, die Änderung der freien Gibb'schen Energie für jeden Zustand zu betrachten

Answer 11

- dG = Vdp - SdT - konstanter Druck: dG/dT = -S - Geht man in erster Näherung von einer temperaturunabhängigen Entropie aus, so ergeben sich für die beiden Zustände, nativ und ungefaltet, zwei Linien mit negativen Steigungen, die den jeweiligen Entropien entsprechen - Der Übergang zwischen den beiden Zuständen erfolgt dann, wenn sich die beiden Linien schneiden - Bei höheren Temperaturen kommt der Hauptbeitrag zur Entropie vom Protein, das im denaturierten Zustand eine höhere Entropie und damit eine steilere negative Steigung hat - Daher ist das Protein ab einer bestimmten Temperatur im entfalteten Zustand stabiler: Entfaltung bei hohen Temperaturen

Answer 12

- S ist Temp.-abhängig - Wärmekapazität: Cp = dH/dT - dH = TdS - -> dS/dT = Cp/T --> S = Cp dT/T --> Integration: S = Sref + Cp ln (T/Tref) - Die Entropie und damit die Steigung der G-T-Kurve nimmt also mit steigender Temperatur zu, wobei der Anstieg der Steigung proportional ist zu Cp - Durch den Logarithmus ist die Abhängigkeit nicht sehr stark

Answer 13

-Typischerweise ist die Wärmekapazität des entfalteten Zustands größer als die des nativen Zustands, weil das Wasser an der hydrophoben Oberfläche der entfalteten Kette stärker strukturiert ist (manchmal als "kleine Eisberge" bezeichnet), so dass etwas Wärme zum "Schmelzen" dieser Struktur benötigt wird -Folglich gibt es einen zweiten Schnittpunkt der beiden Kurven bei niedriger Temperatur, was zur Entfaltung bei niedrigeren Temperaturen führt - Cp = Cp,N - Cp, U analog zur Reaktionsenthalpie oder Entropie --> negatives Ergbenis --> die Enthalphie der Entfaltung ist damit eine FUnktion der Temperautr: dfH = dfHref + (T-Tref) dfCp - mit der Temperautrabhängigkeit von S bei der Entfaltung: dfS = dfSref + dfCp ln (T/tref) --> Gibbs: dfG = dfHref + (T-Tref) dfCp - (dfS(Tref) + dfCp*ln(T/Tref) - um die Wärmekapazität zu bestimmen, werden die Faltungsenthalphie und die Übergangstemp. bei versch. chem. Bedingungen wie pH oder Denaturierungskonz. gemessen -Wichtig ist, dass es keinen Enthalpiebeitrag zur Destabilisierung des Proteins durch die chemische Umgebung gibt - Plottet man die Faltungsenthalpie über T1/2 ergibt sich die Steigung: dUCp = - dfCp

Answer 14

-Der Übergang zwischen den beiden Zuständen erfolgt dann, wenn sich die beiden Linien schneiden -Bei höheren Temperaturen kommt der Hauptbeitrag zur Entropie vom Protein, das im denaturierten Zustand eine höhere Entropie und damit eine steilere negative Steigung hat -Daher ist das Protein ab einer bestimmten Temperatur im entfalteten Zustand stabiler: Entfaltung bei hohen Temperaturen -Typischerweise ist die Wärmekapazität des entfalteten Zustands größer als die des nativen Zustands, weil das Wasser an der hydrophoben Oberfläche der entfalteten Kette stärker strukturiert ist (manchmal als "kleine Eisberge" bezeichnet), so dass etwas Wärme zum "Schmelzen" dieser Struktur benötigt wird -Folglich gibt es einen zweiten Schnittpunkt der beiden Kurven bei niedriger Temperatur, was zur Entfaltung bei niedrigeren Temperaturen führt Generell ist auch die Enthalpie bei einer Temperaturänderung nicht konstant, da die Wärmekapazität (bei konstantem Druck) in den beiden Zuständen, also im Ruhezustand und im gefalteten Zustand, unterschiedlich sein kann --> S = Sref + Cp*ln(T/Tref) --> Die Entropie und damit die Steigung der G-T Kurve erhöhen sich mit der Temperatur. Die Steigung ist prop zu Cp: wegen des ln ist die Anhängigkeit nicht sehr stark

Answer 15

Unter nativen Bedingungen ist noch eine Rest-Sekundärstruktur vorhanden (hauptsächlich eine alpha-Helix-Polyprolin-Helix) - Unter nativen Bedingungen ist das ungefaltete Protein sehr kompakt, kann sogar noch kompakter sein als das gefaltete Protein (molten Glbule) - Unter stark denaturierenden Bedingungen wird die Polypeptidkette gut durch den Gaußschen Kettenmodus beschrieben

Answer 16

- dfG = afF + pdfVm - dG = Vdp - SdT - für konstante Temp.: dG/Dp = V - Auch hier ist in erster Näherung das Volumen unabhängig vom Druck, so dass wir für die beiden Zustände zwei Geraden mit positiven Steigungen haben, wobei die Steigung nur das (molare) Volumen ist - Bei hohen Drücken ist das Volumen der entfalteten Kette kleiner als das Volumen des nativen Proteins, was zu einem Schnittpunkt führt, der die Hochdruckentfaltung zur Folge hat - gefaltet: nimmt trotz gleicher Masse mehr Raum ein --> Hohlräume nicht gefüllt - ungefalteten: keine Hohlräume --> Volumen kleiner - -> durch diese Änderung gibt es beide Übergänge - das molare Volumen ist selbstr Druck-abhängig: dV/dp = -kTV - -> kT: hier isothermale Kompressiibilität - -> Integration: V = Vref * exp(-kT(p-pref)) - Dies führt zu einer Verringerung des Volumens und damit der Steigung der G-p-Kurve - Je größer die Kompressibilität, desto stärker ist die Krümmung der G-Kurve - Der experimentelle Befund, dass sich Proteine auch bei niedrigen Drücken entfalten können, deutet darauf hin, dass die Kompressibilität des denaturierten Zustands größer ist als die des nativen Zustands - Dies wiederum könnte darauf hindeuten, dass der druckdenaturierte Zustand eher eine geschmolzene Globule als eine zufällige Spule ist - Diese Interpretation wird durch Faltungsstudien mit spektroskopischen Techniken wie NMR und Neutronenstreuung unterstützt, bei denen ein Stabilitätsmaximum auch für Druck gefunden wird

Answer 17

- Die freie Energie der Faltung nach Gibb als Funktion der Denaturierungsmittelkonzentration ist gegeben durch: dfG = dfGH20 + [D] dfµ - µ: oft mit dem Symbol mF bezeichnet und als m-Wert bezeichnet, ist der Unterschied im chemischen Potential des Denaturierungsmittels im ungefalteten bzw. nativen Zustand des Proteins - das chemische Potential quantifiziert die Änderung der Gibb'schen freien Energie aufgrund einer Änderung der Menge des freigesetzten Denaturierungsmittels bzw. des proteingebundenen Denaturierungsmittels - Sie spiegelt somit die Affinität des Denaturierungsmittels gegenüber dem Protein im nativen/ungefalteten Zustand wider - Die lineare Abhängigkeit der Gibb'schen freien Energie von der Denaturierungsmittelkonzentration ist wiederum nur bedingt gültig, vielmehr gibt es aufgrund von Aktivitätseffekten eine Krümmung in dieser Abhängigkeit - dµf ist positiv. sodass eine Erhöhung der Denaturierungsmittelkonzentration zu einer Erhöhung der Gibb'schen freien Energie der Faltung führt, wodurch sich das Gleichgewicht in Richtung des entfalteten Zustands verschiebt - µ als Summe aller individuellen Aminosäureresten ai - ai = 0 --> an der Oberfläche, ai=1 --> komplett eingebaut - -> hydrophile AA: µ nahe 0, aber positiv für hydrophobe AA - die Struktur des ungefalteten Zustands hat auch einen Einfluss auf µ und für versch. Substanzen werden versch. Werte gefunden - Das Verhältnis von oberflächenexponierten Resten zu vergrabenen Resten nimmt mit der Größe von kugelförmigen Proteinen ab, da die Oberfläche mit dem Radius zum Quadrat skaliert, während das Volumen mit dem Radius zur dritten Potenz skaliert - Dies führt zu einer zunehmenden Empfindlichkeit (höhere Steigung im Übergang) gegenüber denaturierender Unfaltung mit zunehmender Proteingröße

Answer 18

- dfG = dfG(F=0) + F*dx - dx: Differenz einer Ausdehnung in Richtung der aufgebrachten Kraft im eingefahrenen und ausgefahrenen Zustand Die Kraftentfaltung ist nur auf Einzelmolekülebene möglich, wo Zugversuche zur Aufnahme von Kraft-Dehnungs-Kurven durchgeführt werden

Answer 19

. siehe Karteikarten

Answer 20

- Stopped-Flow-Apparat - Lösung mit Denaturierungsmittel und ohne getrennt (Protein einmal in purer H20-Lösung) - Mixen (1ms) - -> Faltungs-/Entfaltungsreaktion mit spezifischen Gleichgewicht abhängig von [D] - für verschidene Konzentrationen durch führen --> verschieden kobs (alpha+beta)

Answer 21

- die Veränderungen der Aktivierungsenergie für die Faltungsreaktion werden mit den Veränderungen der freie Reaktionsenergie der Faltungsreaktion durch Punktmutationen (Veränderung einer individuellen Aminosäure) verglichen (verhältnis der beiden) - kann Werte zwischen 0 und 1 annehmen - phi = 0 --> die Energie des TS ist um den gleichen Wert wie U verschoben - phi = 1 --> TS ist um den gleichen Wert wie N verschoben - sagt etwas über Faltungsvorgang /entfaltung stattfindet - Die Interpretation der phi-Werte basiert auf der Annahme, dass eine einzelne Punktmutation den Verlauf der Faltungsreaktionen prinzipiell nicht verändert, was voraussetzt, dass nur konservative Mutationen vorgenommen werden, die das Protein signifikant, aber nicht zu stark destabilisieren

Answer 22

- Faltungsreaktion mit keiner oder einer sehr niedrigen Aktivierungsbarriere - Downhill-Faltung ist eine Faltungsreaktion ohne besetzten Übergangszustand zwischen dem nativen und dem denaturierten Zustand - Folglich können beliebige Zwischenzustände entlang des Faltungsweges besiedelt werden, und die Faltung ist ein kooperativer Prozess: - Unter nativen Bedingungen wird für die meisten Proteine downhill angenommen - Vorgeschlagen werden jedoch so genannte globale Downhill-Faltproteine, die sich unter allen Bedingungen nach diesem Mechanismus falten - Die Existenz solcher globaler Downhill-Faltungen wird kontrovers diskutiert - Gemeinsam wird der sogenannte Basislinienübergang in der Differential-Scanning-Kalorimetrie (DSC) als experimenteller Beweis für die globale Downhillfaltung gewertet: - Die Änderungen der Wärmekapazität in den gefalteten/ungefalteten Zuständen sind größer als die Energiebarriere zwischen ihnen (zur Erinnerung: bei der Temperaturentfaltung in zwei Zuständen, Abschnitt 2.4, wurde die Differenz der Wärmekapazität zwischen den beiden Zuständen dFCp als konstant angenommen) - Veränderung in Reaktionsenergie wird nicht zu einer proportionalen Veränderung in der Aktivierungsenergie führen

Answer 23

-Der beste Weg, diese Frage zu klären, ist die Bestimmung des Faltungsübergangs für alle Reste mittels NMR: Wenn der Übergang aller Reste bei der gleichen Denaturierungskonzentration auftritt, ist der Übergang kooperativ, andernfalls könnte es sich um eine Downhill-Faltung handeln -Ein sehr cleverer Weg zur eindeutigen Identifizierung von Downhill-Faltung ist die Durchführung von Einzelmolekülexperimenten In einem Einzelmolekül-FRET-Experiment gibt es für einen Zwei-Zustands-Falter zwei Populationen, deren relative Amplituden sich mit der Denaturierungsmittelkonzentration verschieben Für einen Downhill-Faltungsmechanismus sollte eine allmähliche Verschiebung nur einer einzigen Population von gefaltet zu ungefaltet beobachtet werden

Answer 24

- Hydrophober Kollaps: Bildung eines dicht gepackten Zwischenzustandes, der als geschmolzenes Globuli bezeichnet wird (manchmal sogar kompakter als das native Protein) - Nukleationsmodell: kleiner, lokaler Faltungskeim, von dem aus die Faltung kontinuierlich fortschreitet (kein Zwischenzustand) - Nukleations-Kondensationsmodell: ausgedehnter Kern als Zwischenzustand mit rauer Struktur, der dann konsolidiert wird

Answer 25

- Gleichgewichtsreaktion: P +L <> C - Um das Gleichgewicht durch das Massenwirkungsgesetz quantitativ zu charakterisieren, wird für die Ligandenbindung typischerweise die Dissoziationskonstante KD verwendet: [P][L]/[C] = KD --> Titrationsexperiment --> stetig Ligandenkonzentration hizugeben --> darüber Dissozitationskonstante berechnen - [p]0 frei diffundierendes Protein - - Wenn wir mit f den Anteil des Komplexes am Gesamtprotein bezeichnen: f = [C]/[P]0 -und ersetzen die Konzentration des freien Proteins: [P] = [P]0-[C] --> KD = (([P]0-[C])[L])/[C] = (1-f)[L]/f und schließlich für den Anteil in Abhängigkeit von der Ligandenkonzentration: f = [L]/([L] +KD) (f über [L] auftragen - bei [L] = KD --> f1/2 -Da der Anteil des ligandengebundenen Proteins oft spektroskopisch bestimmt werden kann, ermöglicht dies die Bestimmung von KD (Addition auf der Energieseite entspricht Multiplikation in der Zustandssumme)

Answer 26

- Kontaktbeitrag (tatsächliche Bindung, Chemie) qct --> stärkster negativer Beitrag - translationaler Anteil (Prozess, sich zu finden; am gleichen Ort sein) qt 33 kJ/mol - rotationaler Beitrag (Prozess: richtige relative Ausrichtung (Orientierung) finden) qr 33 kJ/mol - Vibrationaler Anteil (Prozess: Änderung der Vibrationslevel aufgrund von Bindungen) qv -21 kJ/mol - struktureller Anteil (Prozess: Änderung in struktureller Flexibilität aufgrund von Bindungen) qcf - Löslichkeitsbeitrag sbeitrag (Prozess: Änderung von Löslichkeit aufgrund von bindungen) qs < -8 kJ/mol

Answer 27

- Translation: zufällige Bewegung im Raum - energetisch äquivalente Positionen im Raum --> alle Positione haben ein Boltzmanngewicht von 1 - -> Anzahl von posiotionellen Zuständen zählen (wann sind zwei Position eines Moleküls voneinande rzu unterscheiden?) - Raum in Zellen unterteilen (sind zählbar) --> mit der Größe Vcell = lambdadB^3 - lamdadB = h/(sqrt(2pi*m*kB*T)) - qt = V/Vcell = V/(lambda^3) - qcomplex,t/(qL,t * qP.t) = (V/lamda^3c)/(V/lambda^3L *V/lambda^3P) = lambda^3L*lamdba^3P/lambda^3C *1/V = lamda^3L*lamda^3P/lamda^3C * NA *1M - V = 1/(NA *1M) (standard state) - typ: mL << mP --> lambda L >> lambda P --> mc ~ mp, lambda C ~ lambda P - -> qc,t/(qt,L *qt,P) = lambda^3 NA*1M - mit dG = -RT ln(Q) --> -RT ln(lambda^3 / NA *1M) - mit typsichen Werten für die Masse eines Liganden von 100 Dalton: dGt (300K)~ 33 kJ/mol - Protein bindet an Ligand --> extreme Reduktion der Reduktion (Verringerung auf Energieseite), da Bewegung eingeschränkt - bei hoher Konzentration ist Bewegung schon eingeschränkter, da andere Proteine "im Weg" - -> daher standard state mit 1M definiert

Answer 28

- wann ist ein Molekül genug rotiert, sodass es in einem anderen Rotationszustand ist - die Anzahl der Rotationszustände skaliert mit dem Radius: rc ~rp --> nur das EInfrieren der Rotationszustände des Liganden trägt zur Zustandssumme bei - dGr = -RT ln(1/qL,r) - basierend auf lambdadB: 100 Dalton: qL,r ~10^6 - -> 33 kJ/mol

Answer 29

- wenn Ligand an Protein gebunden ist --> zusätzliche Vibrationale Zustände --> 3 Richtungen in die Ligand virbrieren kann in Relation zum Protein und 3 weitere rotationale Zustände --> insgesamt: 6 neue vibrationale Zustände - q^6L,v - durch Äquipartitionstheorem gegeben - dGv = - 21 kJ/mol

Answer 30

- um eine Schätzung für die Löslichkeit zu geben, Modell der kleinen Eisberge - die Bindungoberflächen sind typischerweise hydrophob --> wasser an der Bindungsoberfläche ist ähnlich zu Eis - obere Grenze: Eis --> kann experimentell ermittelt werden - Entropiebeitrag zum Eisschmelzen : -8 kJ/mol für ein Wassermolekül

Answer 31

- kann nicht so einfach abgeschätzt werden, wie anderen Beiträge, da sehr spezifisch - die Bindung kann die Konformation von Ligand und Protein verändern (Flexibilität erhöhen oder verändern) - spezifisch für Interaktion (abhängig von preotein und Ligand) - typischerweise abgeleitet von der Differenz zwischen experimentell bestimmten dG (KD) und geschätzten Werten durch die anderen Beiträge --> kein Unterschied zwischen diese: keine strukturellen Änderungen - kann positiv und negativ sein - -> MD-Simulationen: Bindungsreaktionen simulieren

Answer 32

- P+L -->C - Ratenkonstante nur in eine RIchtung: a (alpha) - x:= [P]0 - [P] (= [C]) - dx/dt = a*[P]*[L] = a*([P]0-x)*([L]0-x) - dx/([P]0-x)*([L]0-x) = adt - spezieller Fall: Startkonzentrationen gleichsetzen; [P]0 = [L]0 --> dx/([P]0-x)^2 = adt - -> Integration: x(t) = (a[P]0^2*t)/(1+a*[P]0*t) für [P]0 ungleich [L]0 --> x = ([P]0*[L]0* (exp(-a [P]0*[L]0)*t)-1))/([L]0*exp(-a[P]0-[L]0)t)-[P]) --> fast exponentiell --> bei starker Anfangsdifferenz: [L]0 >>[P]0 --> [L] bleibt fast konstant --> DGL wird zu 1.Ordnung --> nur Protein- und Komplexkonz. ändern sich --> Pseudo-1,Ordnung-Reaktion: einfache exponentielle Zeitabhängigkeit

Answer 33

- P+L C - a: Vorwärtsrekation, ß: Rückwärtsreaktion - kleine Abweichung vom GG (eq): x - [P] = [P]eq +x, [L] = [L]eq +x, [C] = [C]eq -x - d[P]/dt = -a*[P]*[L]+ß*[C] - d[P]/dt = dx/dt - -> + Störungen: dx/dt = -a*([P]eq+x)*([L]eq+x)+ß*([C]eq-x) - -> dx/dt = -a{([P]eq*[L]eq+x([P]eq+[L]eq)+x^2}+ß*[C]eq-ßx - -> x^2 kann vernachlässigt werden, da es als Quadrat noch geringer ist - -: dx/dt = -a*[P]eq*[L]eq +ß [C]eq - x{a([P]eq+[L]eq)+ß} --> DGL --> Integration mit Startbedingung: x bei t=0 = x0 --> Abweichung vom GG --> Zerfall der Störungen zurück zum GG - -> x(t) = x0*exp((-{a[P]eq+[L]eq}+ß)t) - -> a und ß können nicht aus einer Messung bestimmt werden --> Lösung: Kinetik bei versch. Konz. - -> x(t) = x0*exp(-kapp*t) - kapp = a([P]eq+[L]eq)+ß - zum Beispiel Konzentration des Liganden verändern: kapp über [L]eq plotten --> kapp erhöht sich linear mit [L] mit der Steigung a für [L]eq=0 --> a[P]eq +ß --> analog für Proteinkonzentration

Answer 34

- wenn Ligand und Protein sich finden, binden sie sich direkt --> Ratenlimitierender Faktor - Ligand diffundiert duch Kollisionsoberfläche A des Protein --> Bindung kann stattfinden - [L]-->unendlich: [L]bulk - Assoziation hängt von diffusivem Strom des Liuganden durch die Kollisionsoberfläche ab J = -DL*A*d[L]/dr --> Diffsuiver Strom in Mol/(s*cm^2) (Ficksches Gesetz) - A = 4pi*r^2 = 4pi*(a+b)^2 (Größen: siehe Notizen SKript 12) - d[L]/dr = [L]bulk/(a+b) d[L] = [L]bulk-0 dr = unendlich - (a+b) --> J = -DL 4pi*(a+b)^2 * [L]bulk/(a+b) = -DL 4pi*(a+b)*[L]bulk --> je größer einer der Radien, desto größer die Wahrsch. einer Kollision - -DL 4pi*(a+b) = Vorwärtsreaktionsrate a für [P] = 1 Molekül (Einzelmolekülassoziationsrate) - wenn der Ligand (Normalfall) sehr viel kleiner ist als das Protein: a = 4pi*a*DL = 4pi*a*RT/(6*pi*eta*b) = 2/3 * a/b *RT/eta - DL = RT/(6*pi*eta*b) - eta: Viskosität - Für Bindungen zweier gleichgroßen Teilchen: Diffusionskonstante = Summe beider D - Dp = RT/(6pi*eta*a) --> Assoziationsrate ist nicht mehr abhängig von der Größe der Partikel: a = 8RT/3*eta - in Wasser: ~10^10 M^-1s^-1 - für a>>b (kleiner Ligand, großes Protein) --> die Diffusionsrate kann noch höher werden

Answer 35

- 1D: die beiden Partikel diffundieren linear --> Partikel/nm = 1/b --> 1D = b^2/(3*D1d) --> Partikel müssen keine Größe haben --> sie treffen sich auf jeden Fall --> keine Abhängigkeit der Kollisionszeit von der Größe - 2D: an einer Oberfläche --> möglich, dass sich PArtikel nicht treffen --> Größe des Ziels notwendig --> Flächendichte: Moleküle/nm^2 = 1/b^2 --> 2D = b^2/(2*D2D) * ln (b/a) --> Abhängigkeit von Targetgröße --> je größer Radius a --> desto kürzer die Zeit; je kleiner Konzentration b, desto länger die Zeit - 3D: in Lösung --> Diffusion entlang einer Kugel --> Volumendichte: Moleküle/nm^3 --> 1/b^3 - -> 3D = b^2/(3*D3D) * b/a --> Zeit, dass sich zwei Moleküle sich finden, steigt mit Dimension

Answer 36

- [L] r--> unendlich: 0 - [L] (a+b) = 1/(Vcoll) = 1/(4/3 * pi * (a+b)^3) - Adiss = Aass 4pi*(a+b)^2 - ß = (3*(DP+DL))/((a+b)^2) - Für GG-KOnstante --> Diffusionskonstanten a und ß fallen raus --> GG kann nicht von Geschw. der Diffusion abhängen, nur von der Zeit

Answer 37

- S P --> nicht katalysiert - wenn Substrat und Enzym binden: S+ E SE EP E + P --> katalysierte Reaktion --> thermodynamischer Kreis --> Eigenschaften können nicht durch Enzym verändert werden (keine Änderung von dRG --> Reaktionsenergie nicht betroffen) - -> aber d#G wird verringert (Aktivierungsenergie wird in beide Richtungen verringert) - -> real: Gleichgewicht wird nie erreicht --> konstanter Flow von Molekülen - Produkt einer katalysierten Reaktion reagiert weiter durch eine neue katalysierte Reaktion - Enzym senkt Aktivierungsbarriere

Answer 38

- S+ E <> ES -> E + P - Bindung/Entbindungs-GG: KM - irreversible Reaktion: kcat (P wird weiter verarbeitet) - Enzym kann nach Reaktion erneut an Substrat binden, da es während der Reaktion nicht verändetr wird - ES: Michaelis-Menten-Komplex - Kinetik einer Komplexformation ist wesentlich schneller als Katalyse --> Bindungsreaktion ist im thermodynamischen Gleichgewicht - KM = [E]*[S]/[ES] - [ES] = [E]*[S]/KM - [E]t = [E]+[ES] - [E] = [E]t-[ES] --> KM *[ES] = ([E]t-[ES])*[S] --> KM *[ES] = [E]t*[S]-[ES]*[S] --> [ES]*(KM+[S)] = [E]t *[S] --> [ES] = [E]t*[S]/(KM+[S]) --> Ezym-Substrat-Konzentration - v = -dS/dt= + dP/dt = kcat [ES] = kcat* [E]t*[S]/(KM+[S]) --> Geschwindigkeit der Enzymkatalysierten Reaktion - Geschwindigkeit positive Steigung von Prdoukt oder negative Steigung von Substrat Konzentration über der Zeit - Startgeschwindigkeit = kcat* [E]t*[S]0 /KM+[S]0 - Anfangs: konstante Geschw> steady state. - erhöhen der Start-Substrat-Konzentration --> v steigt - [S]0 >> KM --> KM ist vernachlässigbar --> Vinitial = kcat*[E]t [ES] = [E]t --> höchst mögliche ES-Komnzemtration --> Vinitial, max = kcat[E]t --> v misst indirekt über kcat die ES-Komplex-KOnzentration

Answer 39

- Reaktionsrate über Sustratkonzentration aufgetragen - nicht linearer Fit auf die gemessenen Daten --> Parameter der Modellfunktion verändern (kcat, kM) bis Modellfunktion am besten auf gemessene Daten passt - 1/v = 1/vmax * kM + [S]0/[S]0 = 1/vmax * (kM/[S]0 +1) - 1([S]0 = 0 --> 1/v = 1/vmax --> Steigung: km/vmax - KM = koff/kon - E+S --> ES (kon) andere Richtung koff - ES --> E+P (kcat) - v = (kcat*[E]t*[S])/((koff + kcat)/kon) + [S]) --> genereller Audruck wenn koff >> kcat

Answer 40

- Aufnehmen der Komzentrationen ganz am Anfang der Reaktion --> [ES](t=0) = 0; [E] (t=0) = [E]t, [P](t=0) = 0; [S] (t=0) = [S]0 - -> schnelle Messung --> stopped-flow-Technik - -> nonlinear Kurvenfit --> kon, koff und kcat lassen sich bestimmen - -> kcat ändert d#G (der katalysierten Reaktion) --> Ratenlimitierender Schritt kann sein: ES--> EP oder EP --> E+P - -> kon und koff d#G (der Bindung und Entbindungsreaktion)

Answer 41

- S TS P - S und P sind Minima in EL, TS ist MAximum - Enzym kann an alle Zustände binden - Bindungsenergie: Gibbs free Energie über Reaktionskoordinate --> Siehe Folien - Bindungsenergie: Differenz der katalysierten und nicht katalysierten Reaktion - Bindungsenergie am niedrigsten beim TS --> stärkste Bindung - Enzym stabilisiert TS - strukturelle Lösung von TS --> SUbstrat-analog, das bindet, wird nicht verarbeitet

Answer 42

- nur die Bindung der Substrate (mehr als 1) erhöht die lokale Konzentration drastisch - Schätzem der oberen Grenze der Konzentration: - -> V = lambda,db,substrat^3 - -> Konzentration: 1 Molekül/ V ~ 10^6 - katalysierte: Entropie --> S: hohe Konzentration aufgrund von Bindung

Answer 43

- Röntgenkristallographie - strukturelle Unterschiede, wenn Substrat an Enzym gebundne hat - E+S ES E*S

Answer 44

- zwei Zusätnde des Enzym, ein Zustand stabiler für Bindungen, der andere für chemische Eigenschaften - GG zwischen verschiedenen Zuständen - E E* +S E*S - Apo Enzym bindet eher an einen Substrat dieser als an das andere - E*+P - welcher der Wege (Induced fit oder Konformationsselektion) präferiert wird, hängt vom steady-state-turnover ab (vom Fluss (des SUbstrats) durch das System)

Answer 45

- resultiert aus Experimenten mit Proteinen bei geringen Temperaturen - Tier 0: taxonomische Untertzustände --> meist nur 2 - -> Energiebarriere zwischen beiden ZUständen dG# ~ kT; mit T = physiologische Temperatur (µs-ms) - Tier 1: statistische Unterzustände: (Fluktuationen in Minima von Tier 0) --> in deren Minima weitere Fluktuationen - -> hohe Anzahl, geringe Energiebarrieren (ns) - Tier 2: Few-Level Unterzustände --> Fluktationen in Minima von statistischen Zuständen - -> geringere Anzahl und geringere Energiebarriere (ps) Graphik: Energie über der Struktur aufgetragen

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