Examen 2 (Cours 4) Flashcards
(70 cards)
1
Q
C’est quoi les 3 rôles du système endocytique et de sécrétion ?
A
- Sécrétion de molécules;
- Transport de molécules vers divers organites et vers la membrane plasmique;
- Transport de molécules vers les lysosomes (compartiment acide qui permet la dégradation du matériel biologique).
2
Q
Vrai ou Faux
Le réseau du trans-golgi est un centre de triage qui a plusieurs embranchements pour le destin des vésicules et leurs cargos.
A
Vrai
3
Q
Donne les étapes du processus de transport vésiculaire et de sécrétion . (+ de 5 étapes)
A
- Fabrication des protéines : Les ribosomes sur le RE fabriquent des protéines, qui sont ensuite envoyées directement dans ou à travers la membrane du RE.
- Transport vers le Golgi : Les protéines fabriquées dans le RE sont emballées dans des vésicules qui se dirigent vers le cis-Golgi pour y être traitées.
o Certaines molécules doivent retourner au RE après leur passage dans le Golgi pour y être réutilisées ou réparées. - Circulation des protéines dans le Golgi : Les protéines restantes circulent d’une partie à l’autre du Golgi pour que chaque zone (du Golgi) ait ce dont elle a besoin.
o En même temps, le cis-Golgi se transforme progressivement en trans-Golgi, et ses fonctions évoluent pendant ce processus. - Transport des protéines après traitement dans le Golgi :
o Certaines protéines sont envoyées à la membrane cellulaire en continu et sont libérées sans signal spécifique (sécrétion constitutive).
o D’autres protéines sont envoyées à la membrane seulement après un signal spécifique, comme un message chimique (sécrétion régulée).
o Certaines protéines sont envoyées aux lysosomes pour y être dégradées. - Endocytose : En parallèle, la cellule capture des substances de l’extérieur par endocytose. Ces substances sont ensuite amenées à l’intérieur pour être traitées ou dégradées dans des vésicules.
4
Q
COPII :
- C’est quoi COPII ?
- Quelle est la fonction principale du complexe COPII ?
- De quoi est composé le manteau COPII ? (6)
- Quel rôle joue Sar1 dans le transport antérograde ?
A
- COPII est un complexe protéique qui forme un manteau autour des vésicules, permettant leur transport du RE vers le cis-Golgi. (Vésicule former à partir du RE)
- Il permet le transport antérograde des vésicules du RE vers le cis-Golgi.
- De SEC23, SEC24, SEC13, SEC31, SEC16 et Sar1.
- C’est une GTPase qui initie le bourgeonnement des vésicules du RE.
5
Q
COPI :
- C’est quoi COPI ?
- Quelle est la fonction principale du complexe COPI ?
- De quoi est formé le manteau COPI ?
- Quelle GTPase régule COPI et c’est quoi son rôle dans le transport rétrograde ?
A
- Un complexe protéique impliqué dans le transport du cis-Golgi vers le RE (transport rétrograde) ou vers le trans-Golgi.
- Il forme des vésicules pour ramener des protéines du Golgi vers le RE et pour le transport entre les citernes du Golgi.
- Il est formé de coatomères constitués de sept sous-unités
- Régulé par la GTPase ARF qui aide au bourgeonnement des vésicules.
6
Q
Explique le processus de bourgeonnement vésiculaire (RE vers Cis-Golgi). (6 étapes)
A
- Sar1-GDP est la forme inactive de la GTPase Sar1.
- La GEF (Sec12) favorise l’échange de GDP pour GTP, activant ainsi Sar1 et le transformant en Sar1-GTP.
- Sar1-GTP s’ancre à la membrane du RE et recrute les protéines SEC23 et SEC24, formant le manteau COPII autour de la vésicule.
- Après le bourgeonnement, Sar1-GTP hydrolyse son GTP en GDP, libérant un phosphate inorganique (Pi) et devenant ainsi inactif (Sar1-GDP).
- Sar1-GDP et les protéines du manteau COPII se détachent, laissant la vésicule libre, sans manteau, dans le cytoplasme.
- La vésicule, maintenant nue, est prête à fusionner avec sa membrane cible, comme le cis-Golgi.
7
Q
C’est quoi la première et la dernière étape du transport vésiculaire ? De plus, qu’arrive-t-il si on ne perd pas le manteau ?
A
- La première étape du transport vésiculaire est la formation du manteau (Bourgeonnement).
- La dernière étape du transport vésiculaire est la fusion de la vésicule avec la membrane cible.
- Si on ne perd pas le manteau, il n’y aura pas de fusion avec une membrane et les vésicules vont s’accumuler dans le cytoplasme.
8
Q
Explique comment les vésicules fusionnent avec la membrane après la perte de manteau. (6 étapes)
A
- Rab-GTP est une protéine sur la vésicule qui aide à la guider vers la membrane cible.
- Rab-GTP se fixe à un Rab effecteur sur la membrane, ce qui permet à la vésicule de s’ancrer.
- Une fois la vésicule bien attachée, VAMP (v-SNARE) s’associe avec syntaxin et SNAP-25 (t-SNAREs) pour former un complexe SNARE.
- Le complexe SNARE rapproche les deux membranes jusqu’à ce qu’elles fusionnent, et le contenu de la vésicule est libéré.
- Après la fusion, Rab hydrolyse son GTP en GDP et se détache.
- Puis, NSF et alpha-SNAP démontent le complexe SNARE pour réutiliser les protéines.
9
Q
Ça sert à quoi les SNAREs ?
A
o Permettent la fusion des vésicules avec la membrane cible.
o Une v-SNARE (sur la vésicule) s’associe à une t-SNARE (sur la membrane).
10
Q
Ça sert à quoi les COP (coat proteins) ? (3)
Forment quoi ?
Déterminent quoi ?
Contient quoi ?
A
o Forment la couche extérieure de la vésicule.
o Déterminent le sens du transport (antérograde ou rétrograde).
o Chaque type contient plusieurs protéines.
11
Q
Vrai ou Faux
Lorsqu’un manteau est perdu, il ne peut plus être réutilisé.
A
Faux, les manteaux perdus reviennent à leurs points de départ pour former une nouvelle vésicule.
12
Q
Donne les directions de la clathrine et du complexe AP.
A
- Clathrine
o Direction :
* Du trans-Golgi vers les endosomes ou lysosomes
* De la membrane plasmique vers les endosomes (endocytose) - Complexe AP (Adaptine)
o Direction :
* Du trans-Golgi vers les endosomes (via clathrine)
* De la membrane plasmique vers les endosomes (endocytose)
Pas super important
13
Q
La voie de cGAS-STING est une voie inflammatoire impliquée dans la détection de l’ADN. Explique le processus. (9 étapes)
A
- cGAS détecte l’ADN anormal (exogène ou endogène) dans le cytoplasme.
- cGAS catalyse la production de cGAMP (cyclic GMP-AMP) à partir de GTP et ATP.
- cGAMP se lie à STING (Stimulator of Interferon Genes) dans le réticulum endoplasmique (RE).
- STING est activé par cGAMP, subit un changement de conformation (à 90° ou à 180°) et se polymérise, ce qui permet son transport vers l’ERGIC (compartiment intermédiaire entre le RE et le Golgi).
- À partir de l’ERGIC, STING peut soit continuer son chemin vers le Golgi, soit initier la formation d’autophagosomes pour envoyer le tout aux lysosomes et éliminer l’ADN ou d’autres pathogènes intracellulaires.
- Lorsque STING atteint le Golgi, il subit une palmitoylation, ce qui est nécessaire pour recruter des kinases comme TBK1.
- TBK1 active la phosphorylation de IRF3, un facteur de transcription clé dans la réponse immunitaire.
- IRF3 phosphorylé migre dans le noyau, où il active la production de cytokines inflammatoires et de cytokines de type I, comme IFNβ (interféron bêta).
- Cette activation de IFNβ induit une réponse antivirale et immunitaire pour contrer l’infection.
14
Q
C’est quoi le syndrome COPA (ou la maladie de COPA) ? Les patients présentent quoi (4) ?
A
C’est une mutation dans le gène de COPA, où la production d’interférons se fait de manière continue et excessive. En conséquence, le patient souffre de douleurs inflammatoires inutiles.
C’est décrit comme une maladie qui amène une dérégulation au niveau du système immunitaire et dont les patients présentent une inflammation chronique, des hémorragies alvéolaires, une pneumopathie interstitielle diffuse et des arthrites.
15
Q
C’est quoi la luciférase ?
A
Un gène de luciférase est lié au promoteur de l’interféron. Lorsque ce promoteur est activé, la luciférase est produite, générant de la lumière mesurable.
16
Q
Explique l’expérimentation qui démontre que les variants a-COP activent une réponse avec les interféron-1 qui est dépendante de STING. (Indique les résultats sans STING)
A
Les variants de a-COP sont introduits dans des cellules, certaines avec STING et d’autres sans STING.
SANS STING :
- Les variants de a-COP ne peuvent pas activer STING (car il n’est pas là), ce qui ne déclenche pas de réponse immunitaire et de production d’interféron.
- Le promoteur n’est donc pas activé par STING. La transcription de gènes d’interféron n’est donc pas initié.
- Sans le gène de luciférase lié au promoteur de l’interféron, ce dernier reste inactif et ne génère pas de lumière mesurable. Ainsi, sans STING, il y a peu ou pas de lumière, indiquant l’absence de réponse.
Résultats :
*Lorsque STING n’est pas activé, il n’y a pas de réponse immunitaire, le promoteur d’interféron n’est pas activé, et les interférons ne sont pas produits, ce qui se traduit par une faible émission de lumière de la luciférase.
17
Q
Explique l’expérimentation qui démontre que les variants a-COP activent une réponse avec les interféron-1 qui est dépendante de STING. (Indique les résultats avec STING)
A
Les variants de a-COP sont introduits dans des cellules, certaines avec STING et d’autres sans STING.
AVEC STING:
- Les variants de a-COP activent STING, ce qui déclenche une réponse immunitaire et la production d’interféron.
- L’activation de STING active le promoteur de l’interféron, initiant la transcription de gènes d’interféron.
- Le gène de luciférase, lié au promoteur de l’interféron, est activé, produisant de la lumière mesurable. La lumière produite et émise est intense, montrant que la réponse interféron dépend de STING.
Résultats :
*Lorsque STING est activé, une réponse immunitaire se produit, le promoteur d’interféron est activé, et les interférons sont produits, ce qui est démontré par une intense émission de lumière de la luciférase.
18
Q
Explique l’expérimentation qui démontre que les variants a-COP activent une réponse avec les interféron-1 qui est dépendante de STING. (Donne la conclusion)
A
Les variants a-COP activent une réponse avec les interféron-1 qui est dépendante de STING, car sans STING ils n’arrivent pas à activer de réponse.
19
Q
Explique le processus utilisant la luciférase comme marqueur. (5 étapes)
A
- Un gène de luciférase est lié au promoteur de l’interféron.
- Lorsque STING est activé, il active le promoteur de l’interféron.
- Le promoteur activé entraîne la production de luciférase dans la cellule.
- La luciférase catalyse une réaction avec la luciférine, produisant de la lumière.
- L’intensité de la lumière émise est mesurée, indiquant l’activation du promoteur de l’interféron
20
Q
Explique l’expérimentation qui démontre que la voie de signalisation de STING est activée en absence d’ADN stimulant avec les mutants de a-COP. (Déroulement et résultats)
A
Principe :
* Phospho-TBK1 (p-TBK1) est un marqueur de l’activation de STING.
* On exprime des variants de α-COP (mutants) dans des cellules avec ou sans STING.
* On mesure le niveau de p-TBK1 par Western blot.
* Si p-TBK1 ↑, cela signifie que STING est activé.
________________________________________
Ce que montre le gel (résultats) :
1. Sans STING (Sting⁻/⁻) :
→ Peu ou pas de p-TBK1, même avec α-COP mutants.
→ STING est nécessaire à l’activation.
2. Avec STING (Sting⁻/⁻ + EGFP-STING) :
o α-COP mutants (surtout E241K, D243G)
→ Fort signal p-TBK1, même sans ADN
→ Donc : STING est activé sans ADN, uniquement par les mutants α-COP.
o α-COP WT ne cause pas cette activation anormale.
21
Q
Explique l’expérimentation qui démontre que la voie de signalisation de STING est activée en absence d’ADN stimulant avec les mutants de a-COP. (Conclusion)
A
- Les mutants de α-COP activent STING sans ADN stimulant.
- Cela est démontré par l’augmentation de la phosphorylation de TBK1 (p-TBK1), qui n’apparaît que lorsque STING est présent.
Sans STING → pas d’ERGIC → pas de p-TBK1.
o En effet, lorsque STING recrute TBK1 et que ce dernier est phosphorylé, cela indique l’activation de STING, car TBK1 se dirige ensuite vers la plateforme de signalisation pour phosphoryler les facteurs de transcription de l’interféron, déclenchant ainsi la réponse antivirale. - Ainsi, la voie STING est anormalement activée par les mutants de α-COP, indépendamment de la présence d’ADN.
22
Q
Pour montrer que les mutants des protéines COP activent des gènes de l’interféron et de l’inflammation, les chercheurs ont fait l’expérience suivante… (4 étapes + Résultat)
A
Utilise la quantification par RT-qPCR des gènes d’inflammation :
-
Ils expriment les mutants COP dans des cellules en culture.
→ Cela permet d’observer directement l’effet des protéines COP modifiées sur la cellule. -
Après un certain temps, ils extraient l’ARN des cellules.
→ L’ARN extrait reflète l’activité des gènes dans la cellule à ce moment précis, indiquant lesquels sont activés. -
Ils transforment l’ARN en ADNc (via rétrotranscription) pour pouvoir le mesurer.
→ Cette étape est nécessaire pour pouvoir mesurer l’expression des gènes, car la PCR se fait sur de l’ADN, pas de l’ARN. -
Ils réalisent une qPCR avec des amorces spécifiques des gènes inflammatoires et des gènes de l’interféron.
→ Cette étape permet de quantifier l’expression de ces gènes (augmentation ou non des ARNm). -
Résultat :
→ On observe une augmentation de l’expression de ces gènes chez les cellules exprimant les mutants COP,
→ Ce qui montre que ces mutants déclenchent une réponse inflammatoire et antivirale.
23
Q
Expliquer en quoi la perte d’expression de SURF4 et l’expression des mutants de COPA ont un effet similaire sur l’activation de STING.
A
Lorsqu’il y a des mutants de COPA, STING et P-TBK1 restent localisés au Golgi
- Empêche le transport rétrograde des vésicules (du Golgi vers le RE)
- Lorsque l’expression de SURF4 est perdu, STING et P-TBK1 restent également localisés au Golgi
- Empêche également le transport rétrograde des vésicules (du Golgi vers le RE)
Conclusion :
La perte de SURF4 et l’expression des mutants de COPA (α-COP) ont en commun :
👉 Elles bloquent toutes les deux le transport rétrograde (du Golgi vers le RE).
👉 À cause de ça, STING reste bloqué au Golgi, au lieu de retourner au RE.
👉 Résultat : STING s’active tout seul, même sans ADN viral → activation de P-TBK1 → réponse immunitaire anormale.
Donc, SURF4 et COPA mutant provoquent la même activation anormale de STING, en perturbant le trafic cellulaire.
24
Q
C’est quoi l’anémie de Fanconi (FA) ?
A
C’est un trouble génétique de réparation d’ADN qui peut mener à l’échec de moelle osseuse, à la leucémie, et/ou aux tumeurs solides (cancer).
25
L’anémie de Fanconi (FA) est causée par l’un des ___ gènes au moins. FA peut affecter tous les systèmes de l’organisme. Il s’agit d’une maladie complexe et chronique qui est psychologiquement exigeante.
Le FA est presque ___________ chez les hommes et les femmes et se retrouve dans tous les groupes ethniques. Aux États-Unis, la probabilité qu’un enfant naisse avec une FA est d’environ 1 sur ____ ____, et environ ___ bébés naissent chaque année.
Si les deux parents portent une mutation dans le même gène FA, ils ont ___% de chance d’avoir un enfant avec FA.
23
identique
131 000
31
25%
26
Vrai ou Faux
Plus de la moitié de la population FA inscrite auprès du FARF a 18 ans ou plus.
Vrai
27
Comment la FA affecte le corps ? (trop de réponses)
- Rayon plus court ou manquant
- Anomalies de la main et du pouce
- Effets psychosociaux
- Retards de développement
- Perte auditive
- Cancer de la bouche
- Cancer de la tête et du cou
- Malformations cardiaques
- Troubles digestifs
- Malformations rénales et urinaires
- Problèmes liés à la reproduction
- Cancer de la vulve
- Cancer de l’anus
- Corps entier : numérations sanguines anormales, insuffisance de moelle osseuse, leucémie, problèmes dermatologiques, carence hormonale et petite taille.
28
Vrai ou Faux
Les personnes atteintes de FA peuvent éprouver un seul symptôme à la fois.
Faux
Les personnes atteintes de FA peuvent éprouver n’importe quelle combinaison de symptômes, allant d’un à plusieurs.
29
Décrit ce qu’est la voie de Fanconi. (5 étapes)
1. Le complexe FANC-M–MHF1–MHF2 reconnaît les dommages de type pont inter-brins (ICL).
2. FANCM s’active et recrute le complexe central de la voie Fanconi.
3. Le complexe central (complexe FANC), qui a une activité E3 ubiquitine ligase, ajoute un groupement ubiquitine au complexe ID2 (FANCI-FANCD2).
4. Des nucléases comme FANCP, FANCG et FAN1 sont recrutées pour couper l’ADN autour du dommage.
5. Selon le contexte cellulaire, la réparation se fait soit par recombinaison homologue (HR), soit par recombinaison non homologue (NHEJ).
30
Le voie de Fanconi :
1. Elle est impliquée dans quoi ?
2. Elle compte combien de protéines qui ont un rôles différents?
3. Nomme d'autres fonctions cellulaires de la voie de Fanconi. (3)
4. La voie dirige quoi ?
1. Le voie de Fanconi est impliquée dans la réparation des dommages à l’ADN, spécifiquement des pontage inter-brins.
2. Le voie de Fanconi compte 23 protéines qui ont différents rôles durant la réparation des dommages à l’ADN.
3. Les protéines de la voie Fanconi ont aussi d’autres fonctions cellulaires comme dans la cytocinèse, l’autophagie et la réplication de l’ADN.
4. La voie de Fanconi dirige la réparation des dommages vers la voie de recombinaison homologue qui permet de garder l’intégrité du matériel génétique .
31
Explique ce qui arrive lorsqu’il y a un défaut dans le complexe FANC de la voie de Fanconi.
Le syndrome d’Anémie de Fanconi est causé par quoi ?
Un défaut de la voie dirige les réparations de dommages à l’ADN vers une voie plus mutagénique, le NHEJ (Non-homologous End Joining) la recombinaison non-homologue.
* Le syndrome d’Anémie de Fanconi est causé par une dysfonction des protéines du complexe FANC.
32
C'est quoi la recombinaison homologue et ses étapes ? (5 étapes)
* Utilise une copie identique (souvent la chromatide sœur) pour réparer la cassure.
* Étapes clés :
1. Le complexe MRN repère la cassure et crée des protubérances (bouts) simple brin.
2. RPA se fixe pour protéger les bouts, puis Rad51 prend sa place (aidé par Rad52).
3. Rad51 aide le brin cassé à s’attacher à la chromatide sœur.
4. L’ADN polymérase recopie l’ADN manquant depuis la chromatide sœur.
5. Les brins sont recollés, l’ADN est réparé.
✅ Réparation précise, sans perte d’information.
33
C'est quoi la recombinaison non homologue (NHEJ) et ses étapes ? (4 étapes)
* Colle directement les extrémités cassées de l’ADN, sans modèle.
* Étapes clés :
1. Ku70/80 se fixent sur les extrémités cassées de l’ADN.
2. DNA-PK est recrutée pour rapprocher les deux extrémités → formation d’un complexe synaptique.
3. Si les bouts ne sont pas bien compatibles, des enzymes les coupent ou les modifient.
4. Le complexe ligase IV/XRCC4 recolle les brins.
⚠️ Moins précis → risque de perte ou ajout de bases → mutations possibles.
34
Nomme les 3 expériences qui prouvent que les cellules avec un défaut de la voie de Fanconi activent plus fortement la protéine P53.
1. Les cellules avec un défaut de la voie de Fanconi activent plus fortement la protéine P53 en réponse à un agent de pontage de l’ADN
2. Accumulation de p53 chez les cellules de patients de FA
3. Utilisation d’un modèle de souris pour mieux comprendre la signalisation cellulaire induite par un défaut dans la voie de Fanconi
35
Explique l'expérience qui démontre que les cellules avec un défaut de la voie de Fanconi activent plus fortement la protéine P53 en réponse à un agent de pontage de l’ADN. **(Méthode + résultats)**
Méthode :
- On utilise la MMC, qui endommage l’ADN.
- On traite différentes cellules (lymphocytes, fibroblastes, cellules de moelle osseuse) avec des doses croissantes de MMC (0 à 75 ng/ml).
- On mesure la quantité de p53, une protéine qui signale un stress à l’ADN.
- L’actine sert de contrôle pour s’assurer qu’on compare des quantités équivalentes de protéines.
Résultats :
1. Lymphocytes activés (PHA-PBL)
Contrôle (non-FA) : p53 reste bas, même avec beaucoup de MMC.
Cellules FA : p53 augmente fortement dès de faibles doses → elles sont plus sensibles.
2. Fibroblastes
FANCA déficient : p53 augmente beaucoup avec la MMC → hypersensibilité.
FANCA corrigé (complémenté) : la réponse redevient normale → preuve que le défaut venait bien de FANCA.
3. Moelle osseuse
Sauvage (WT) : faible activation de p53.
Fancc⁻/⁻ : p53 augmente beaucoup → sensibilité accrue au stress de l’ADN.
36
Explique l'expérience qui démontre que les cellules avec un défaut de la voie de Fanconi activent plus fortement la protéine P53 en réponse à un agent de pontage de l’ADN. **(Conclusion)**
Les cellules déficientes pour des gènes de la voie de Fanconi (FANCA, FANCC) montrent une surcharge de p53 en réponse à la MMC, ce qui confirme que cette voie est cruciale pour la réparation des ponts inter-brins. Quand elle est défectueuse, les cellules accumulent des dommages → activation de p53 → arrêt du cycle ou apoptose.
37
Explique pourquoi l’accumulation de p53 dans les cellules de patients atteints de l’anémie de Fanconi peut contribuer à la fois à l’aplasie médullaire et à la prédisposition au cancer.
Chez les patients atteints de la maladie de Fanconi, l’incapacité à réparer correctement l’ADN active fortement p53.
Cette activation excessive conduit à l’apoptose des cellules souches hématopoïétiques, causant une aplasie médullaire.
En parallèle, une dérégulation chronique de la réponse à l’ADN et des erreurs de réparation augmentent le risque d’accumuler des mutations, ce qui favorise le développement de cancers.
38
Des cellules déficientes en FANCD2 (shFANCD2) présentent une activation de p53 et de p21, même en l’absence d’irradiation. Explique ce que cette observation révèle sur le rôle de la voie de Fanconi dans la réponse aux dommages à l’ADN.
L’absence de FANCD2 perturbe la voie de Fanconi, empêchant une réparation efficace des dommages à l’ADN.
Cela provoque une activation de p53 et de p21, même sans irradiation externe, ce qui indique que les cellules accumulent spontanément des dommages.
Cela montre que la voie de Fanconi est essentielle pour maintenir la stabilité de l’ADN, même en conditions basales, et que sa déficience entraîne une activation chronique de la réponse au stress, notamment par p53.
39
Qu’est-ce qui cause l’aplasie médullaire chez les patients Fanconi ?
1. Mutation génétique dans les gènes du complexe de réparation de l'ADN de Fanconi.
2. Défaillance de la réparation des lésions de l'ADN.
3. Instabilité génétique accrue.
4. **Altération des cellules souches hématopoïétiques.
o Moelle osseuse défaillante = moins de cellules souches hématopoïétiques.**
5. **Réduction de la production de cellules sanguines (globules rouges, globules blancs, plaquettes).
o Moins de cellules souches = moins de cellules sanguines.
o Moins de cellules sanguines = moins de globules rouges et blancs.
o Moins de globules rouges et blancs = anémie et infections.**
6. Aplasie médullaire (moelle osseuse incapable de produire suffisamment de cellules sanguines).
7. Risque accru de leucémie et de cancers du sang.
40
Explique l’expérience qui permet de prouver que la perte de p53, en même temps que la perte de FANCD2, permet de retrouver un nombre presque normal de cellules souches de la moelle osseuse. **(Les 3 étapes + les résultats)**
Résultats : Les cellules sélectionnées sont ensuite analysés et voici les résultats...
1. % de LSK (cellules souches LSK (Lin-, Sca-1+, Kit+)) retrouvés.
2. Nombre de cellules LSK en vie.
3. Capacité de former des colonies de LSK sur un tissu de cellules.
**Étape 1** : Isolée les cellules souches sanguines avec le marqueur Lin-
* Les cellules souches sanguines sont négatives pour les marqueurs Lin-, donc on prend les cellules qui ne réagissent pas avec Lin- (encadrer rouge).
**Étape 2** : Les cellules souches sanguines isolées qui ont testé négatif pour Lin- sont maintenant mis en contacte avec c-Kit et Sca-1, qui sont également des marqueurs de cellules souches.
* Les cellules souches sanguines sont positives pour les marqueurs c-Kit et Sca-1, donc on prend les cellules qui réagissent avec c-Kit et Sca-1 (encadrer rouge).
**Étape 3** : Les cellules sélectionnées sont ensuite analysés et voici les résultats.
1. % de LSK (cellules souches LSK (Lin-, Sca-1+, Kit+)) retrouvés :
* WT et déplétion de p53 + FANCD2 ont plus de cellules que déplétion de FANCD2.
2. Nombre de cellules LSK en vie :
* WT et déplétion de p53 + FANCD2 ont plus de cellules en vie que déplétion de FANCD2.
3. Capacité de former des colonies de LSK sur un tissu de cellules :
* WT et déplétion de p53 + FANCD2 ont plus de colonies que déplétion de FANCD2.
41
Explique l’expérience qui permet de prouver que la perte de p53, en même temps que la perte de FANCD2, permet de retrouver un nombre presque normal de cellules souches de la moelle osseuse. **(Les conclusions)**
Les cellules normales restent toujours les plus efficaces, mais si on subit une déplétion de FANCD2, il est n’est pas parfait mais il est plus avantageux de déplété p53 également sinon les cellules vont mourir plus vite.
* La perte de FANCD2 seule cause une perte importante de cellules souches (elles meurent rapidement).
* Mais si on enlève aussi p53, les cellules survivent mieux et se comportent presque comme les cellules normales.
* ❗ Cela montre que p53 est responsable de l’apoptose des cellules déficientes en FANCD2.
* Donc, supprimer p53 "sauve" partiellement les cellules souches.
42
Explique l’expérience qui permet de tester si des cellules souches hématopoïétiques humaines (CD34⁺) déficientes pour FANCD2 peuvent encore produire des cellules sanguines après greffe chez la souris, et si le retrait de p53 change quelque chose. **(Étapes + résultats)**
Étape expérience (partie C) :
1. On prend des cellules souches CD34⁺ du sang de cordon humain.
2. On les rend déficientes :
o soit pour FANCD2 seul (shFANCD2),
o soit pour FANCD2 et p53 (shFANCD2-TP53).
3. On greffe ces cellules dans des souris immunodéficientes (NSG).
4. On regarde si ces cellules souches greffées réussissent à produire des cellules humaines (CD45⁺) dans les souris.
________________________________________
Résultats (parties D & E) :
Partie D :
* À 5 semaines après greffe :
o shFANCD2 seul → très peu de cellules humaines détectées (CD45⁺, GFP⁺ = 4.9 %).
o shFANCD2-TP53 → beaucoup plus de cellules humaines (34.1 %). → Sans p53, les cellules FANCD2⁻ sont capables de mieux se développer.
Partie E :
* À 5 et 16 semaines, même tendance :
o Les cellules shFANCD2 seules ne persistent pas.
o Les cellules shFANCD2-TP53 restent présentes plus longtemps → greffe réussie.
43
Explique l’expérience qui permet de tester si des cellules souches hématopoïétiques humaines (CD34⁺) déficientes pour FANCD2 peuvent encore produire des cellules sanguines après greffe chez la souris, et si le retrait de p53 change quelque chose. **(Conclusion)**
* Les cellules déficientes pour FANCD2 échouent à se maintenir après greffe.
* Si on enlève aussi p53, elles survivent et fonctionnent. → p53 bloque la fonction des cellules FANCD2⁻ en activant une réponse au stress. → Pour restaurer leur capacité de greffe, il faut inhiber p53.
44
Explique comment la déplétion de FANCD2 peut entraîner une perte des cellules souches hématopoïétiques, en intégrant les notions de division cellulaire, dommages à l’ADN et apoptose. ( 6 points)
1. La déplétion de FANCD2 empêche la réparation efficace des dommages à l’ADN, ce qui entraîne leur **accumulation**.
2. Cela active les mécanismes de surveillance cellulaire, notamment la protéine p53, qui reste fonctionnelle et détecte les anomalies.
3. En parallèle, les cellules présentent un **défaut de cytocinèse**, ce qui conduit à la **formation de cellules binucléées**.
4. Face à ces **anomalies** (dommages à l’ADN et division défectueuse), p53 déclenche rapidement l’apoptose.
5. Cela se traduit par un **pourcentage élevé de cellules annexin V positives**, indiquant une forte proportion de cellules en train de mourir.
6. Au final, **cette activation massive de l’apoptose entraîne une perte des cellules souches hématopoïétiques**.
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Donne la conclusion générale des expériences qui permettent de prouver que la perte de p53 + perte de FANCD2 est plus efficace que juste la perte de FANCD2.
* Les cellules de patients atteints de la maladie de Fanconi (FA) présentent une accumulation de dommages à l’ADN et une augmentation de l’apoptose.
* La protéine p53 est activée en réponse aux dommages à l’ADN et induit l’apoptose lorsque les bris ne peuvent pas être réparés.
* Chez les souris Fancd2-/-, la perte de p53 permet de réduire significativement la perte des cellules souches hématopoïétiques.
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Il existe une problématique a utilisé la déplétion de p53 pour corriger la perte de FANCD2. C'est quoi ?
L'absence de p53 favorise le développement de tumeurs, car les cellules endommagées ne sont plus éliminées. Donc pas très utile finalement.
Il est donc nécessaire de trouver des solutions alternatives qui protègent les cellules souches sans augmenter le risque tumoral.
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Explique comment l’inhibition du TGF-B permet de sauver les cellules souches hématopoïétiques et la moelle osseuse en cas d’anémie par le fanconi.
Permet d'augmenter quoi ?
**L’inhibition du TGF-B permet d'augmenter la recombinaison homologue qui est moins risquée.**
- **Survie améliorée des HSC**
La signalisation accrue du TGF-B permet d'augmenter la recombinaison non homologue qui est plus risquée.
- Pert de HSC
- Défaillance de la moelle osseuse.
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Indiquer comment ils ont trouvés la voie de TGF-B ? (2 expériences/tests)
A) Analyse des gènes activés par un stress génotoxique (MMC)
B) Survie des cellules FA-A (qui sont déficientes en FANCA) avec ou sans SMAD3 (tester la survie avec et sans SNAD3)
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Expliquer l'analyse des gènes activés par un stress génotoxique (MMC).
* Une analyse à grande échelle a été faite pour identifier les gènes activés après un stress à l’ADN, causé ici par la mitomycine C (MMC).
* Plusieurs gènes ont été mis en évidence :
o Gènes de la voie TGF-β : BMP2, SMAD3, PDCD4 → indiqués par une flèche.
o Gènes du métabolisme de la MMC : NQO1, NFE2L2 → indiqués par une pointe de flèche.
* Cela suggère que la voie TGF-β est activée après un dommage à l’ADN, en plus des gènes qui gèrent la détoxification de la MMC.
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Expliquer la survie des cellules FA-A avec ou sans SMAD3 (étapes + résultats)
Deux types de cellules sont testées :
* GM6914 : fibroblastes FA-A (déficients en FANCA).
* GM6914 corrigées : fibroblastes avec FANCA fonctionnel.
* FANCA est un gène qui code pour une protéine de la voie de réparation de l’ADN, appelée voie de Fanconi.
Dans chaque cas, SMAD3 est inactivé avec un shRNA, puis les cellules sont exposées à la MMC.
Résultat :
Les cellules avec SMAD3 inactivé et FANCA survivent mieux après MMC, contrairement a ceux sans FANCA.
* Contrôle avec SMAD3 (sans FANCA) = Ne survie pas vraiment
* SMAD3 inactivé (sans FANCA) = Survie mieux
* Contrôle avec SMAD3 + FANCA = Survie + mieux
* SMAD3 inactivé + FANCA = Survie ++ mieux
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Donne la conclusion de l'analyse des gènes activés par un stress génotoxique (MMC) et de la survie des cellules FA-A avec ou sans SMAD3 (tester la survie avec et sans SNAD3).
La voie TGF-β, via SMAD3, semble aggraver la sensibilité à la MMC dans les cellules Fanconi. Inhiber SMAD3 pourrait donc être une piste thérapeutique pour protéger ces cellules sans toucher à p53.
* On parle ici des cellules de patients atteints de la maladie de Fanconi, plus précisément des fibroblastes FA-A (déficients en FANCA), comme les cellules GM6914 utilisées dans l’expérience.
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Nomme les 3 expériences qui permettent de voir si la voie TGF-β, via SMAD3, nuit à la prolifération et au maintien des cellules souches hématopoïétiques chez les souris Fancd2−/−, et si l’inhibition de SMAD3 peut améliorer leur survie et leur fonction.
A) Analyse des gènes activés chez les cellules LSK (cellules souches)
B) Culture in vitro avec shRNA contre SMAD3
C) Test de greffe (in vivo)
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Comment l’analyse des gènes activés dans les cellules LSK (cellules souches hématopoïétiques) a-t-elle permis d'étudier l'activation de la voie TGF-β chez les souris Fancd2−/− ?
Les cellules analysées dans cette étude sont des cellules LSK (Lin−, Sca-1+, c-Kit+) provenant de la moelle osseuse.
Une comparaison a été réalisée entre des souris WT (wild-type) et des souris Fancd2−/− (déficientes en FANCD2).
L'RT-qPCR a été utilisée pour mesurer l’expression des ARNm de plusieurs gènes.
Les gènes analysés incluent ceux de la voie TGF-β, à savoir Tgfb1 et Smad3, ainsi que des gènes cibles impliqués dans la régulation du cycle cellulaire, de l’immunité et de l’autophagie, tels que Cdkn1a (p21), Cdkn1c, Foxp3 et Atg5.
**Résultat :**
Les gènes associés à la voie TGF-β (Tgfb1, Smad3) et d’autres gènes sont plus exprimés dans les cellules Fancd2−/− par rapport aux cellules WT. Cela montre que la voie TGF-β est anormalement activée dans ces cellules.
Pas de FANCA = Dommage à l'ADN = + TFG-B = Ralentissement de la prolifération cellulaire pour essayer de ne pas diviser les cellules endommagées.
**Conclusion :**
Cette activation de la voie TGF-β pourrait ralentir la prolifération des cellules souches ou induire leur apoptose (mort cellulaire), ce qui contribue à la perte des cellules souches hématopoïétiques chez les souris Fancd2−/−.
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Comment l'inhibition de SMAD3 affecte-t-elle la survie et la prolifération des cellules souches hématopoïétiques dans un modèle de souris Fancd2−/− ? Explique l'expérience menée avec shRNA contre SMAD3 et les résultats obtenus.
* Cellules Lin− de moelle osseuse de souris WT et Fancd2−/−.
* Transduction avec :
o shSmad3-GFP : pour inhiber SMAD3.
o shCtrl-GFP : contrôle.
* Culture pendant 5 jours, puis analyse par cytométrie.
* On regarde : le % de cellules GFP+ (transduites) dans les populations LSK.
* Résultat :
o Chez les cellules Fancd2−/−, la déplétion de Smad3 augmente le nombre de cellules LSK → meilleure survie ou prolifération.
o Cet effet est moins marqué chez les cellules WT, car elles vont déjà bien.
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Explique le test de greffe (in vivo).
* 20 000 cellules Lin−, GFP+ (CD45.2) sont transplantées dans des souris receveuses CD45.1 (irradiées pour éliminer leur propre moelle).
* Ajout de cellules de soutien (1×10⁵ CD45.1).
* On mesure, à 4 et 16 semaines, le % de cellules sanguines dérivées du donneur (GFP+ CD45.2+) dans le sang des receveurs.
* Résultat :
o Les cellules Fancd2−/− avec shSmad3 (donc sans SMAD3) réussissent mieux la greffe que les Fancd2−/− avec shCtrl (donc avec SMAD3).
o Chez les WT, moins de différence.
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Donne la conclusion des 3 expériences qui permettent de voir si la voie TGF-β, via SMAD3, nuit à la prolifération et au maintien des cellules souches hématopoïétiques chez les souris Fancd2−/−, et si l’inhibition de SMAD3 peut améliorer leur survie et leur fonction.
* Chez les souris Fancd2−/−, la voie TGF-β (via SMAD3) est trop active, ce qui freine la prolifération des cellules souches hématopoïétiques.
* Cela active aussi des gènes comme p21, qui bloque le cycle cellulaire.
* En inhibant SMAD3, on améliore :
o La prolifération des cellules souches en culture,
o Leur survie,
o Leur capacité à reconstituer le sang après greffe.
* ➕ Cela offre une alternative à l’inhibition de p53, qui est risquée à cause du cancer.
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Nomme les 3 expériences qui permettent de tester si bloquer la voie TGF-β (avec l’anticorps 1D11) aide les cellules souches hématopoïétiques (CSH) chez les souris Fancd2−/− à mieux survivre et réparer l’ADN après un stress génotoxique (acétaldéhyde).
A) Test de formation de colonies
B) Réparation de l’ADN (foyers γH2AX)
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Explique le test de formation de colonies.
* CSH WT et CSH Fancd2−/− sont exposées à 2 mM d’acétaldéhyde pendant 4 h (cause des bris d’ADN).
* Ensuite, elles sont cultivées dans un gel (méthylcellulose) contenant :
o 1D11 (anticorps qui bloque la voie TGF-β)
o ou un anticorps contrôle/isotype (sans effet).
* Après 10 jours, on compte les colonies formées (reflète la survie et la prolifération).
* Résultat :
o Les cellules Fancd2−/− + 1D11 forment plus de colonies que celles avec le contrôle (Fancd2−/− + isotype).
→ Le blocage de TGF-β améliore leur survie.
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Explique la réparation de l’ADN (foyers γH2AX).
* Après exposition à l’acétaldéhyde, on mesure les foyers γH2AX (marqueurs de bris d’ADN).
* Les CSH sont soit traitées avec :
o 1D11 (anti-TGF-β),
o soit un anticorps contrôle/isotype.
* Analyse à différents moments (post-traitement).
* Résultat :
o Les CSH Fancd2−/− + 1D11 montrent moins de foyers γH2AX que celles avec contrôle (CSH Fancd2−/−).
→ Cela indique une meilleure réparation de l’ADN.
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Donne la conclusion des 3 expériences qui permettent de tester si bloquer la voie TGF-β (avec l’anticorps 1D11) aide les cellules souches hématopoïétiques (CSH) chez les souris Fancd2−/− à mieux survivre et réparer l’ADN après un stress génotoxique (acétaldéhyde).
Le blocage de la signalisation TGF-β avec 1D11 :
* Améliore la survie des cellules souches FA,
* Favorise la réparation de l’ADN,
* Et protège contre les effets toxiques de l’acétaldéhyde.
Cela en fait une piste thérapeutique prometteuse pour les patients atteints de l’anémie de Fanconi.
???
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Explique l’expérience qui permet de voir si inhiber la voie TGF-β (via inactivation de SMAD3) aide à activer la réparation de l’ADN par recombinaison homologue (HR) dans des cellules Fanconi. **(Méthode + résultats)**
Méthode :
* Cellules utilisées :
o GM6914 : fibroblastes de patients FA-A (déficients en FANCA).
o GM6914 corrigées : même type de cellules, mais avec le gène FANCA ajouté (fonctionnel).
* Traitement :
o Les cellules sont exposées à 1 µM de mitomycine C (MMC) pendant 6 heures, puis la MMC est retirée (pulse).
o Les cellules sont laissées en récupération pendant 24 ou 48 heures.
* Analyse :
o On détecte les foyers de RAD51, un marqueur de l’activation de la réparation par recombinaison homologue (HR).
o On évalue 100 cellules pour quantifier le nombre de foyers RAD51.
________________________________________
Résultats :
* Les cellules corrigées avec FANCA et avec SMAD3 inactivé montrent plus de foyers RAD51.
* Cela indique une meilleure activation de la voie HR.
* En comparaison, les cellules sans inhibition de SMAD3 présentent moins de foyers RAD51.
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Explique l’expérience qui permet de voir si inhiber la voie TGF-β (via inactivation de SMAD3) aide à activer la réparation de l’ADN par recombinaison homologue (HR) dans des cellules Fanconi. **(Conclusion)**
L'inhibition de la voie TGF-β via SMAD3 améliore la réparation des bris d’ADN en favorisant la recombinaison homologue. C’est une piste intéressante pour renforcer la réponse à l’ADN endommagé dans les cellules Fanconi.
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Vrai ou Faux
Plus il y a de cGAS, plus il y aura d'interféron, car il active STING qui active le promoteur de l'interféron, initiant la transcription de gènes d'interféron.
Vraio
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Quelle protéine servant au transport des vésicules COP pourrait être déplétée pour empêcher l’activation de STING ?
SAR-1 (si on le bloque, on bloque STING et le transport)
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Quel est le rôle de l’ADN dans la première expérience du papier COPA qui montre l’activation de TBK1 ?
activer cGAS
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Nommez les GEF (facteur d’échange de guanine) pour les vésicules COPI et COPII?
COPII : Sec12 (page 4)
COPI : on ne sait pas (pas dans le cours)
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Nommez les principales conséquences de l’activation de p53 ?
Diminue cellules hématopoïétiques
Arrête le cycle cellulaire (apoptose)
Active la senescence
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5. Que signifie une hausse d’Annexin 5 à la surface des cellules ?
Une hausse d’Annexin 5 (ou Annexine V) à la surface des cellules signifie que ces cellules sont en train d’entrer en apoptose (mort cellulaire programmée).
L’Annexine 5 se lie à un lipide appelé phosphatidylsérine. Normalement, ce lipide est à l’intérieur de la membrane cellulaire. Mais lors de l’apoptose, il est exposé à l’extérieur.
Donc, si l’Annexin 5 se fixe à la surface, cela montre que la cellule est en train de mourir par apoptose.
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Quelle serait la conséquence de traiter les patients Fanconi avec un inhibiteur de p53 ?
Ils vont avoir le cancer (augmente la possibilité d’avoir le cancer car plus de mutation)
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Que signifie la présence de foci RAD51 et yH2AX ?
γH2AX :
→ Marque les cassures double brin de l’ADN.
→ C’est un signal d’alerte précoce.
RAD51 :
→ Impliqué dans la réparation de l’ADN par recombinaison homologue.
→ Sa présence en foci indique que la cellule essaie de réparer ces cassures.
