F5 Flashcards
(21 cards)
Proteiner har 2 fundamentalt olika sätt att interagera med andra molekyler
- Katalytisk interaktion (enzymfunktion)
– Proteinet fungerar som enzym
– Binder till en substratmolekyl och omvandlar dess kemiska struktur eller sammansättning
– Exempel: hydrolys av ATP, omvandling av glukos till glukos-6-fosfat - Reversibel bindning till ligand (icke-katalytisk funktion)
– Proteinet binder en ligand (kan vara ett annat protein, ett litet molekyl eller ett joner) utan att ändra dess struktur
– Exempel:
– Myoglobin/Hemoglobin binder syre
– Antikroppar binder antigener
– Inbindningen är ofta specifik och reglerbar, t.ex. genom induced fit eller allosterisk reglering
Vad är en ligand?
Molekyl som tillfälligt binder till ett protein
Bindningen sker vid ett specifikt bindningsställe på proteinet
Kan vara vilken typ av molekyl som helst (t.ex. små molekyler, joner, andra proteiner)
Orsakar inte nödvändigtvis en kemisk förändring av sig själv eller proteinet
Bindningen är oftast reversibel
Interaktionen är ofta specifik – proteinet känner igen och binder bara vissa ligander
Exempel:
– O₂ är ligand till myoglobin/hemoglobin
– Antigener är ligander till antikroppar
Vad är betydelsen av reversibel bindning av protein och ligand?
Gör det möjligt för cellen att reglera biologiska processer dynamiskt
Tillåter snabb respons på förändringar i miljön (t.ex. syrenivåer, näringstillgång)
Viktig för funktioner som:
– Syretransport (t.ex. hemoglobin)
– Signaltransduktion (receptorer binder tillfälligt signalmolekyler)
– Immunförsvar (antikroppar binder tillfälligt till antigener)
Affiniteten (hur starkt proteinet binder liganden) kan justeras av:
– Koncentrationen av ligand
– Allosteriska modulatorer
Möjliggör finjustering av proteinets aktivitet utan att permanent förändra det
Vad är en prostetisk grupp?
En icke-proteinmolekyl som är permanent bunden till ett protein
Krävs för att proteinet (ofta ett enzym) ska vara funktionellt aktivt
Kan vara en organisk molekyl eller en metalljon
Till skillnad från coenzymer är den inte löst bunden och inte utbytbar
Deltar ofta direkt i proteinets kemiska reaktion eller bindning
Exempel:
– Hemgruppen i hemoglobin och myoglobin (binder syre via Fe²⁺)
– FAD i vissa redoxenzymer
Hur används hem i biologiska sammanhang?
Hem är en prostetisk grupp, dvs. en permanent bunden organisk kofaktor till proteiner.
Hem binder Fe²⁺, vilket möjliggör reversibel syrebindning i proteiner som myoglobin och hemoglobin.
- Myoglobin lagrar syre i muskelvävnad.
- Hemoglobin transporterar syre i blodet och binder det kooperativt.
Järnjonen i hem binder syre (O₂) – denna bindning stabiliseras av en närliggande histidinsidokedja.
Kolmonoxid (CO) binder hem mycket starkare än O₂ om hem är fritt – proteinmiljön minskar denna affinitet kraftigt.
Hemoglobin regleras allosteriskt av molekyler som 2,3-BPG, som minskar dess affinitet för O₂ och möjliggör syrefrisättning i vävnader.
Inbindning av O₂ till hem utlöser konformationsändringar i hemoglobin (från T till R-form), vilket ökar dess affinitet – en förutsättning för kooperativ bindning.
Hem är en porfyrin – en plan, cyklisk struktur med Fe²⁺ i centrum – liknande struktur som i klorofyll (där Mg²⁺ används i stället för Fe²⁺).
Hur binder globiner till syre?
Hem-grupp krävs:
- Globiner (t.ex. myoglobin och hemoglobin) binder syre via en hem-grupp som innehåller Fe²⁺ i centrum.
Järnjonens roll:
- Syre (O₂) binder direkt till Fe²⁺ i hem.
- Fe²⁺ måste hållas i rätt oxidationstillstånd för att syrebindning ska vara reversibel.
Histidiners påverkan:
- En proximal histidin (F8) binder direkt till järnet.
- En distal histidin (E7) stabiliserar det bundna syret via en vätebindning till O₂.
Bindningsspecificitet och orientering:
- Hemproteinet (t.ex. myoglobin) formar en ficka som tvingar syret att binda i en viss vinkel, vilket gynnar O₂ över CO.
- Denna miljö minskar CO:s annars mycket högre affinitet.
Konformationsändring vid syrebindning (framförallt i hemoglobin):
- När O₂ binder dras Fe²⁺ in i hemplanet → utlöser en konformationsförändring.
- Denna förändring sprids till andra subenheter (i hemoglobin) → kooperativ bindning.
Myoglobin vs. Hemoglobin:
- Myoglobin: en enkel syrebindande enhet (lagring), hyperbol bindningskurva.
- Hemoglobin: tetramer (2α + 2β), transport av syre, sigmoidal bindningskurva pga kooperativitet.
Jämvikten mellan protein och ligand, associations- och dissociationskonstanterna, jämvikstkonstanterna Ka och Kd
Reversibel bindning:
- Protein (P) binder reversibelt till en ligand (L) → bildar ett komplex (PL): P+L⇌PL
Associationskonstant (Ka):
- Mått på hur starkt liganden binder till proteinet.
- Definition: Ka = [PL] / [P][L]
- Hög Ka = hög affinitet (stark bindning).
Dissociationskonstant (Kd):
- Mått på hur lätt komplexet faller isär:
Kd = [P][L] / [PL] = 1/Ka
- Låg Kd = hög affinitet (stabilt komplex).
Hastighetskonstanter:
- ka = associationshastighet (M⁻¹s⁻¹)
- kd = dissociationshastighet (s⁻¹)
- Förhållandet:
Ka = ka/kd, Kd = kd/ka
Hur man får ett experimentellt mått på affinitet. Bindningskurvan
Affinitet mäts genom mättnadsgrad (Y):
- Y = (upptagna bindningsställen) / (totalt antal bindningsställen)
- Kan också uttryckas som:
Y = [L] / ([L] + Kd)
Mätmetod (assay):
- En signal (t.ex. spektroskopi, fluorescens, absorbans) används för att mäta mängden bundet ligand vid olika [L].
- Signalen är proportionell mot Y.
Bindningskurva:
- Plottar Y mot ligandkoncentration [L].
- Formen på kurvan avslöjar bindningsbeteendet:
– Hyperbolisk: enkel bindning (t.ex. myoglobin)
– Sigmoidal: kooperativ bindning (t.ex. hemoglobin)
Bestämning av Kd
- Vid Y=0.5 → [L]=Kd
- Dvs. den ligandkoncentration där hälften av bindningsställena är upptagna.
Fördelar med bindningskurva:
- Visar både affinitet (från kurvans mittpunkt) och bindningstyp (från kurvans form).
- Kurvpassning används för att beräkna exakta värden på Kd och felmarginaler.
Grafisk tolkning:
- Bindningskurvor kan konstrueras för att uppskatta Kd (och därmed Ka) från experimentella data.
I vilka storleksområden ligger biologiska affiniteter?
Affinitet uttrycks som Kd (dissociationskonstant):
- Enhet: molar (M)
- Lägre Kd → högre affinitet
Typiska Kd-värden för biologiska interaktioner:
- Stark bindning: Kd ≈ 10⁻¹⁰ till 10⁻⁹ (t.ex. antikropp-antigen, biotin-avidin)
- Måttlig bindning: Kd ≈ 10⁻⁸ till 10⁻⁶ M (t.ex. hormon-receptor, enzymsubstrat)
- Svag bindning: Kd ≈ 10⁻⁵ till 10⁻³ M
Myoglobins syreaffinitet: Kd ≈ 2.8 x 10⁻⁴ M
Hemoglobins syreaffinitet (P50):
motsvarar ≈ 26mmHg → konverterbart till Kd
Affinitetsområdet möjliggör reglering:
- Affiniteten måste vara anpassad till fysiologiska koncentrationer av ligand.
Skillnad mellan myoglobin och hemoglobin
Funktion:
- Myoglobin: Lagrar syre i muskelvävnad.
- Hemoglobin: Transporterar syre i blodet (från lungor till vävnader).
Struktur:
- Myoglobin: Monomer (en subenhet).
- Hemoglobin: Tetramer (4 subenheter – 2 α och 2 β).
Syrebindning:
- Myoglobin: Enkel, icke-kooperativ bindning.
- Hemoglobin: Kooperativ bindning – bindning av O₂ ökar affiniteten i andra subenheter.
Bindningskurva:
- Myoglobin: Hyperbolisk.
- Hemoglobin: Sigmoidal (på grund av kooperativitet).
Affinitet för syre:
- Myoglobin: Hög affinitet; binder syre vid låga koncentrationer.
- Hemoglobin: Lägre initial affinitet, men ökar med varje bunden O₂ (kooperativitet).
Funktionell anpassning:
- Myoglobin: Effektiv vid syrelagring i muskler.
- Hemoglobin: Effektiv vid syretransport och frisättning där det behövs.
Allosterisk reglering:
- Myoglobin: Inte allosteriskt reglerat.
- Hemoglobin: Regleras allosteriskt av t.ex. 2,3-BPG, pH och CO₂.
Vad menas med “induced fit”?
Induced fit betyder att bindningen av en ligand orsakar en konformationsändring i proteinet.
Denna förändring förbättrar passformen mellan protein och ligand – ökar bindningens styrka.
Anpassningen sker efter att liganden börjat binda – inte före.
Induced fit bidrar till hög specificitet även om liganden inte är en perfekt match från början.
Vanligt i enzymer, transportproteiner (t.ex. hemoglobin) och antikroppar.
Exempel: När syre binder hemoglobin, ändras strukturen från T (tens) till R (relaxed)-form, vilket ökar affiniteten för mer syre.
Vad menas med kooperativitet?
Kooperativitet innebär att bindning av en ligand till ett protein påverkar bindningen av ytterligare ligander.
Vanligt i proteiner med flera bindningsställen, t.ex. hemoglobin.
När en ligand binder → sker en konformationsändring som ökar (positiv kooperativitet) eller minskar (negativ kooperativitet) affiniteten i andra bindningsställen.
Hemoglobin visar positiv kooperativitet: första O₂-molekylen binder svagt, men ökar affiniteten för nästa → ger sigmoidal bindningskurva.
Beskrivs kvantitativt med Hill-ekvationen och Hill-koefficienten.
Kooperativitet möjliggör effektiv inbindning vid hög O₂-nivå (lungor) och frisättning vid låg O₂-nivå (vävnader).
Kooperativ syrebindning i hemoglobin
Hemoglobin består av 4 subenheter (2 α + 2 β) – varje har en hem-grupp som kan binda syre.
När en O₂-molekyl binder, sker en konformationsändring från T-form (tens, låg affinitet) till R-form (relaxed, hög affinitet).
Denna förändring ökar affiniteten hos de andra subenheterna för syre → positiv kooperativitet.
Resultatet är en sigmoidal bindningskurva (inte hyperbolisk som i myoglobin).
Kooperativiteten gör att hemoglobin:
- Binder effektivt till O₂ i lungor (hög pO₂)
- Släpper O₂ i vävnader (låg pO₂)
Hill-koefficienten (n > 1) används för att kvantifiera graden av kooperativitet.
Kooperativ syrebindning är avgörande för hemoglobins funktion som syretransportör.
Positiv kooperativitet
Inbindning av första liganden ökar affiniteten för efterföljande ligander.
Exempel: Hemoglobin – första O₂ ökar affiniteten i övriga subenheter.
Ger en sigmoidal bindningskurva.
Effektiv vid transport – binder snabbt vid hög koncentration och släpper vid låg.
Hill-koefficient (n) > 1.
Negativ kooperativitet
Inbindning av första liganden minskar affiniteten för efterföljande ligander.
Mindre vanligt än positiv.
Ger en flackare bindningskurva.
Kan fungera som regleringsmekanism – skyddar mot övermättnad.
Hill-koefficient (n) < 1.
Vad heter ekvationen och grafen, som visar graden av kooperativitet? (namn, inga detaljer)
Ekvationens namn: Hill-ekvationen
Grafens namn: Sigmoidal bindningskurva (för kooperativ bindning)
Vad menas med allosterisk reglering?
Allosterisk reglering innebär att en ligand binder till ett regulatoriskt säte (inte det aktiva säte) på ett protein.
Denna bindning orsakar en konformationsändring i proteinet.
Denna förändring påverkar affiniteten för en annan ligand i ett annat säte på samma protein.
Kan vara:
- Homotropisk: modulatorn är samma som liganden
- Heterotropisk: modulatorn är en annan molekyl än liganden
Exempel: BPG binder allosteriskt till hemoglobin och minskar dess affinitet för O₂.
Allosterisk reglering i hemoglobin
Hemoglobin är ett allosteriskt protein med flera bindningsställen för O₂.
När en O₂-molekyl binder, sker en konformationsändring (från T-state till R-state).
Denna förändring ökar affiniteten för O₂ i de andra subenheterna (positiv kooperativitet).
2,3-bisfosfoglycerat (BPG) binder allosteriskt till hemoglobin (ej vid hemsätet).
BPG stabiliserar T-konformationen, vilket minskar affiniteten för O₂.
Detta hjälper hemoglobin att släppa O₂ i vävnader med låg syrehalt.
Generell struktur hos IgG (antikroppar)
IgG består av två tunga kedjor och två lätta kedjor.
Varje kedja har en variabel domän och en konstant domän.
De variabla domänerna (en från tung och en från lätt kedja) bildar tillsammans det antigenbindande sätet.
Två antigenbindande säten per IgG-molekyl.
IgG har en Y-formad struktur.
Bindning till antigen kan orsaka induced fit, en konformationsändring som förbättrar passformen.
Affinitet mellan antikropp och antigen
Antikroppar binder specifikt och med hög affinitet till sina antigen.
Affiniteten mäts med dissociationskonstanten (Kd).
Lågt Kd-värde betyder stark bindning (hög affinitet).
Kd-värden för antikropp–antigeninteraktioner kan vara så låga som 10⁻¹⁰ M.
Bindningen förbättras genom induced fit, där både antikropp och antigen kan ändra form för bättre passform.
3 Metoder som använder antikroppar
ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)
– Använder antikroppar för att detektera och kvantifiera specifika proteiner eller antigener.
Immunfluorescensmikroskopi
– Använder fluorescensmärkta antikroppar för att lokalisera specifika molekyler i celler eller vävnader.
Western Blotting
– Identifierar specifika proteiner i ett proteinextrakt genom antikroppsbindning efter separering via elektrofores.
