Proteinbiosynthese Prokaryoten Transkription
Zelle benötigt: -DNA-Strang der als Matrize dient & kopiert wird
- Nukleosidtriphosphate als Bausteine der RNA-Synthese (ATP, CTP, GTP, UTP) - RNA-Polymerase als katalysierendes Enzym
1) Initiation
2) Elongation
3) Termination
Proteinbiosynthese Prokaryot Transkription Initiation
Bindung der RNA-Polymerase an den Promotor (=spezifische Region der DNA); enthält TATAAT-Sequenz
Proteinbiosynthese Prokaryot Transkription Elongation
RNA wird synthetisiert
Polymerase entspiralisiert Doppelhelix der DNA (ca. Um jeweils 15 Basenpaare)
Polymerase liest liest Matrizenstrang (Codogener Strang) in 3’ ->5’
An das 3’-Ende des wachsenden Stranges werden komplementäre Ribonukleosidtriphosphate (zu den Nukleotiden)von der Polymerase gebunden
RNA-Strang wird von 5’ ->3’-Richtung verlängert; Antiparallel zum DNA-Matrizenstrang
Nach dem Abschreiben eines DNA-Abschnittes bildet sich wieder eine Doppelhelix
RNA wird von DNA abgelöst
Proteinbiosynthese Prokaryot Transkription Termination
RNA-Polymerase gelangt am Ende des Gens zum Terminator
RNA-Polymerase wird von DNA gelöst
Transkription beendet
RNA entspricht einer exakten komplementären Kopie des Gens und dient später als Vorlage für die Synthese von Polypeptiden
Proteinbiosynthese Prokaryot Translation Initiation
MRna zu Aminosäuresequenz
Initiationsfaktoren unterstützen den Vorgang
30S-Untereinheit der Ribosomen bindet an eine Basensequenz, die sich in der Nähe des Startcodons AUG befindet(tRNA mit komplementären Anticodon UAC)
Synthase knüpft Methionin an, daran modifizierten Formylrest (fMet)
50S-Untereinheit vervollständigt Ribosom/Startkomplex
Proteinbiosynthese Prokaryot Translation Elongation
Eine mit Aminosäure beladene tRNA mit komplementären Anticodon bindet an das nächste Codon der mRNA in der A-Stelle
2 Reaktionen werden von Ribosomen katalysiert
1) löst Bindungen der Aminosäure und ihrer tRNA an der P-Stelle –> Dipeptid
2) unbeladene tRNA wandert an E-Stelle, Bindung mit mRNA wird anschließend gelöst. Im Cytoplasma wird sie mit neuer Aminosäure beladen
AS-Kette wird von P-Stelle an A-Stelle verlagert
Ribosom bewegt sich um ein Codon weiter in 5’->3’-Richtung
zwei GTP werden verwandelt
Elongationsfaktoren unterstützen
Proteinbiosynthese Prokaryot Translation Termination
Stoppcodon gelangt an A-Stelle, kein tRNA hat ein komplementäres Anticodon, keine tRNA kann binden; Translation bricht ab. An das Stoppcodon bindet ein Release-Faktor
AS-Kette wird von der tRNA gelöst, Polypeptid befindet sich im Cytoplasma
Durch Terminationsfaktoren unterstützt
Katalysieren die Ablösung des neu synthetisierten Polypeptids von der tRNA
Beladung der Transfer-RNA
1) Aminosäure wird unter ATP-Verbrauch an das aktive Zentrum der Aminoacyl-tRNA-Synthetase gebunden
2) ATP spaltet Pyrophosphat ab und der AMP-Rest wird mit der Aminosäure verbunden
3) tRNA (spezifisch auf Aminosäure passend) wird kovalent mit Aminosäure verknüpft; AMP-Rest wird verdrängt
4) “beladene tRNA” wird freigesetzt (Aminoacyl-tRNA)
DNA
Desoxyribonukleinsäure Hauptsächlich im Zellkern Pentose, Phosphorsäure, vier verschiedene organische Stickstoffbasen Adenin und Guanin (Purinbasen) Cytosin und Thymin (Pyrimidinbasen)
Adenin und Thymin; zwei Wasserstoffbrückenbindungen
Cytosin und Guanin; drei Wasserstoffbrückenbindungen –>komplementär zueinander
Zucker und Phosphatrest wechseln sich immer ab (Spitze zeigt in 3’-Ende); Antiparallel
Zahl und Bau der Chromosomen
46 Chromosomen
22 homologe Chromosomenpaare: Autosomen
1 Paar Gonosomen
Kurzer Arm (p-Arm), langer Arm (q-Arm)
Mitose
ProMATI
Prophase: Chromosomen liegen entspiralisiert vor –>spiralisieren sich; Kernhülle zerfällt, Nucleoli löst sich auf; Spindelfaserapparat bildet sich an Zellpolen
Metaphase: Anordnung an Äquatorialebene, Spindelfasern setzen am Centromer an; Kernhülle komplett aufgelöst
Anaphase: Chromosomen werden zu Chromatiden getrennt; Spindelfasern verkürzen sich, Chromatiden zu Zellpolen gezogen
Telophase: Entspiralisierung der Einchromatidchromosomen; neue Zell- und Kernmembran wird gebildet
Cytokinese: Kernteilung; Teilung des Cytoplasmas
Interphase: G1: Zellwachstum, Vermehrung der Organellen
S: Verdopplung der DNA
G2: Kontrolle
Mendelsche Regeln
1) Uniformitätsregel/Reziprokitätsregel
Wenn man zwei homozygote Individuen aus der Parentalgeneration kreuzt, die sich in einem Merkmal unterscheiden (z.B. Farbe), setzt sich das dominante gegenüber dem rezessiven durch; alle Nachkommen in der F1-Generation prägen Uniform das dominante Merkmal aus
Bei einem intermediären Erbgang würden sie uniform eine Mischfarbe ausprägen, da beide Allelen dominant (unvollständige Dominanz) sind ->monohybrid
2) Spaltungsregel/Segregationsregel
Wenn man zwei heterozygote Individuen kreuzt, erhält man in deren F-Generation Nachkommen, die dieses Merkmal phänotypisch in einem Verhältnis von 3:1 ausprägen; Genotypisch 1:2:1
Intermediärer Erbgang: drei Möglichkeiten (z.B. weiß, rot und Mischfarbe rosa)
3) Unabhängigkeitsregel/Neukombinationsregel
wenn zwei Merkmale auf verschiedenen Chromosomen, werden sie unabhängig voneinander vererbt, dadurch entstehen neue Kombinationsmöglichkeiten (Phänotyp: 9:3:3:1; Genotyp zu kompliziert)
DNA-Replikation
Semikonservativ
Topoisomerase entspiralisiert die Doppelhelix im zu replizierenden Abschnitt
Helikase trennt die Wasserstoffbrückenbindungen der Basen
Aufgetrennte Stellen =Replikationsgabel
Leitstrang (3’-Ende zu 5’-Ende) kann kontinuierlich synthetisiert werden, da DNA-Polymerase in 5’-Richtung läuft
Primase befestigt Primer an 3’-Ende des Mutterstranges (Primer-Annealing); Primer kennzeichnet den Anfang, DNA-Polymerase wandert ab dem Primer am Mutterstrang entlang und fügt die komplementären Nukleotide hinzu
Beim Folgestrang müssen mehrere Primer angebracht werden; Primase muss eine Lücke lassen, bevor sie einen Primer anbringt
DNA-Polymerase setzt am Primer an, springt dann an nächsten Primer, bis Einzelstrang Komplementär synthetisiert ist
Aufgrund diskontunuierlichen synthetisierung bleiben Okazaki-Fragmente
DNA-Ligase baut alle Primer ab, verbindet DNA-Stücke zu einem durchgehenden Strang
Stammbaumanalyse
- Gonosomal oder auotosmal?
- rezessiv oder dominant?
Autosomal-dominant Autosomen-rezessiv X-Chromosomal-dominant X-Gonosomal-dominant X-Chromosomal-rezessiv Y-Chromosomal
Hinweise: dominant oder rezessiv?
Dominant: Merkmal tritt in jeder Generation auf
Gesunde Eltern haben gesunde Nachkommen
Zwei phänotypisch kranke Eltern haben ein phänotypisch gesundes Kind
Rezessiv: phänotypisch gesunde Eltern haben ein phänotypisch krankes Kind
Autosomales: tritt bei Männern und Frauen auf
Wird von Männern und Frauen an Söhne vererbt
In rezessiven Erbgang hat phänotypisch gesunder Vater kranke Töchter
In dominanten Erbgang hat ein phänotypisch kranker Vater phänotypisch gesunde Töchter
Gonosomal: Töchter sind bei rezessiver Vererbung nur dann phänotypisch krank, wenn auch der Vater phänotypisch krank ist
Mutationen
Zufällige Veränderungen der Erbinformation
- Genommutation
- Genmutation
- Chromosomenmutation
Somatische Mutation: in Körperzellen (nicht vererbbar)
Keimbahnmutationen: in Keimzellen (vererbbar)
Chromosomenmutationen
Deletion: ein Segment fehlt vollständig (z.B. Katzenschreisyndrom)
Duplikation: ein Segment tritt in dem selben Chromosom doppelt auf
Translokation: Segment wurde auf ein nicht homologes Chromosom übertragen und dort am Ende oder in der Mitte eingebaut
-balancierte Translokation: zwei Chromosomen (meistens 14 u. 21) liegen fusioniert vor (erblich bedingt); 45 Chromosomen, allerdings ist alles wichtige dabei; phänotypisch unauffällig
-unbalancierte Translokation: bei Keimzellenbildung entstehen Ungleichverteilunngen der Chromosomen; es entstehen normale Keimzellen, Keimzellen mit 14/21, Keimzellen mit 21, Keimzellen mit 14 Quantitative Veränderung in Zygote; phänotypisch auffällig
Inversion: Segment um 180* gedreht und wieder eingebaut
wenn kein genetisches Material verloren geht, kann der Betroffende phänotypsich unauffällig sein
je größer der Abschnitt, desto gravierender die Auswirkungen
Genommutation
Nondisjunction: homologe Chromosomen werden bei Keimzellenbildung fehlverteilt
Werden entweder nicht getrennt: Haploide Keimzellen mit 24 oder 22 Chromosomen (liegen zweifach oder gar nicht vor)
Oder: sie werden bei Chromatidenteilung in der zweiten Reifeteilung nicht zu Einchromatidchromosomen geteilt (werden auf die selbe Zelle verteilt)
Monosomie ist letal
Genommutation auf 13, 18 oder 21 sind lebensfähig
Genmutation
Veränderung innerhalb eines Gens
Punktmutation: komplementäre Basen werden substituiert -stumme Mutation: auf einem Intron hat es keine Auswirkungen; auf einem Exon, wird es hier aufgrund der Degeneration des genetischen Codes in die selbe Aminosäure codiert
-Misssense-Mutation: verändert Triplett so sehr, dass eine andere Aminosäure codiert wird; Aminosäure hat ähnliche Eigenschaften, für das Protein nicht relevant
.Nonsense-Mutation: verändert Triplett so sehr, dass ein Stopp-Codon codiert wird; Translation wird vorzeitig abgebrochen; verkürztes, funktionsloses Protein
Rasterschubmutation: Tripletts verändern sich (wenn keine Vielzahl von drei entfernt oder hinzugefügt wird)
- Deletion: Verlust
- Insertion: Hinzufügen
Spontanmutation: z.B. Durch Replikationsfehler; Desaminierung
Mutigere: können durch chemikalische oder physikalische Faktoren entstehen
Physikalische Mutagene: Röntgen- und UV-Strahlung
-Röntgen: verursacht Strangbrüche der DNA
-UV: Thymindimer können entstehen =>sterben häufig ab
chemische Mutagene: Basenanaloga können bei Replikation in der DNA anstelle der normalen Basen eingebaut werden ->fehlerhafte Basenpaarung
PCR
Polymerase-Chain-Reaction: künstliche Replikation
Amplifikation
Vorhandene DNA in Pufferlösung
1) Denaturierung (ca. 94 Grad): DNA zu Einzelsträngen
2) Hybridisierung (ca. 60 Grad): Primer kommen zum Einsatz, binden an je einen der beiden Einzelstränge
3) Polymerisierung (ca. 72 Grad): Taq-Polymerasen synthetisieren neuen Strang vom 5’ zum 3’-Ende
Konjugation
Horizontaler Gentransfer
DNA wird über Sexpilus übertragen
Fertilitätsfaktor (F-Faktor): Fähigkeit DNA zu übertragen, auf bestimmten Plasmiden
Sender: F+-Zellen; können Sexpilus ausbilden
Empfänger: F–Zellen; ohne F-Faktor
Hfr: High frequency of recombination: F-Faktor im Bakterium-Chromosomen, nur Teile des F-Faktors übertragen, F–Zelle bleibt F–Zelle
Transkonjugation: durch Konjugation hervorgegangene neue F+-Zelle
Hfr-Zellen: nicht nur F-Faktor, auch genetische Information werden übertragen ->Rekombination ->Antibiotikaresistenz
=>Parasexualität
Genetischer Code
Jede AS = drei Basen= Triplett oder Codon
Gesamtheit aller Codons ist der genetische Code
Eigenschaften: Überlappungsfrei (eine Base gehört einem Triplett an)
Kommafrei (keine bedeutungsfreien Basen)
Eindeutig (eine AS durch eine bestimmtes Triplett)
Degeneriert (Versch. Tripletts können gleiche AS codieren)
Universell (gleicher genetischer Code für viele Lebewesen; wenig Ausnahmen)
Proteinbiosynthese Eukaryoten Transkription Initiation
Entstehung der prä-RNA
RNA-Polymerase bindet an DNA
Proteinbiosynthese Eukaryoten Transkription Elongation
Matritzenstrang in 3’ in 5’-Richtung ablesen
Verknüpfung komplementärer Ribonukleotide von 5’ bis 3’-Richtung
Proteinbiosynthese Eukaryoten Transkription Termination
Loslösung; Erreichen des Ende des Gens
RNA-Processing
Reifungsprozess, damit RNA aus Zelle ausgeschleust werden kann
5’-Ende: 5’-Cap-Struktur
3’-Ende: Poly-A-Schwanz
Verhindern vorzeitigen Abbau
Ermöglichen korrekte Anlagerung der Ribosomen an die mRNA im Cytoplasma
Spleißen: herausschneiden der Introns aus prä-mRNA durch das Spleißosom
=>Reife mRNA =Transkriptionsprodukt eines einzelnen Gens, codiert für ein ganzes Polypeptid
Alternatives Spleißen: manche Introns werden dringelassen; Exons werden in verschiedener Reihenfolge miteinander verbunden
Eukaryoten mRNA: monocistronisch
prokaryoten mRNA: polycistronisch
Reife mRNA erhält Proteinhülle
Qualitätskontrolle an Kernporen
Proteinbiosynthese Eukaryoten Translation
Initiation: 5’-Cap-Struktur notwendig
(So wie sonst)
Chaperone katalysieren zusätzlich zu spontanen Wechselwirkungen zwischen den AS, das sich Primärstruktur in Sekundär- und Tertiärstruktur faltet (richtige Ausbildung dieser)
Meiose
Vorgang der Geschlechtszellenreifung
1. Reifeteilung:
Prophase I: Zweichromatidchromosomen liegen in Transportform
Spindelfaserapparat bildet sich an Zellpolen
Kernhülle löst sich auf
(2n 4c)
Metaphase I: homologe Chromosomen ordnen sich paarweise an der Äquatorialebene an
Mikrotubuli setzen am Centromer an
Anordnung der mütterlichen und väterlichen Chromosomen ist zufällig ->interchromosomale Kombination
späte Metaphase I: crossing-over findet statt (homologe Chromosomen tauschen untereinander Informationen aus, wenn sie in der Tetrade liegen)
Anaphase I: Spindelfasern verkürzen sich, ziehen ganze 2-Chr.Chr. zu Zellpolen
Telophase I: W: es entsteht eine große Zelle und ein Polkörperchen
M: es entstehen zwei gleich große Zellen
1n 2c
Prophase II: neue Kernhüllen wurden gebildet und Zellen sind getrennt zweiter Spindelfaserapparat (1n 2c)
Metphase II: Mikrotubuli des Spindelfaserapparates setzen an den Centromeren der 2-Chr.Chr. an
Anaphase II: Mikrotubuli verkürzen sich und ziehen 1.Chr.Chr. zu Zellpolen
Telophase II: Zellen trennen sich ab: W: eine große Eizelle, drei kleine Polkörperchen
M: vier gleich große Spermienzellen
1n 1c
Reifung: W: Haploide Eizelle bildet eine Kernhülle aus, Polkörperchen werden abgebaut
M: Haploide Spermien sind in Kopf (mit Sprengsatz) und Geißel (mit Energiepaketen) unterteilt
Genregulation bei Prokaryoten
Substratinduktion
Endproduktrepression
Substratinduktion
Expression eines Gens aufgrund eines äußeren Signals
Beispiel: lac-Operon
Strukturgene lac Z, lac Y und lac A codieren lactoseabbauende Enzyme
Operator: DNA-Region, die Genen vorangeschaltet ist
Repressor: Protein, das an den Operator binden kann
Promotor: liegt vor dem Operator
Promotor + Operator + Strukturgene bilden lac-Operon
Regulatorgen: DNA, die Repressor codiert
Aktiver Repressor bindet an Operator, blockiert RNA-Polymerase und Enzymsynthese
Wenn Lactose im Medium vorhanden ist, bindet diese an Repressor, räumliche Struktur verändert sich, Inaktivierung, löst sich von Operator
RNA-Polymerase dockt an Promotor, liest Strukturgene ab; Enzymsynthese
Enzyme spalten Lactose in Glukose und Galactose; Lactosekonzentration sinkt; Lactose löst sich vom Repressor, Aktivierung, bindet sich an Operator
Endproduktrepression
Endprodukt einer Synthese schaltet die Enzymsynthese ab
Beispiel trp-Operon
trp-Operon umfasst Promotor, Operator und fünf Strukturgene
Regulatorgen wird in mRNA transkribiert und mRNA wird translatiert in inaktiven Repressor
trp-Mangel ->RNA-Polymerase dockt an Promotor und liest Strukturgene ab
synthetisierte Enzyme stellen aus 5 Schritte Tryptophan her, wenn ausreichend Tryptophan vorhanden ist, bindet Trp an Repressor, wird aktiviert wird und an Operator andockt: Enzymsynthese wird inaktiviert
Adulte Stammzellen
Zellen, die sich ständig teilen
Für Erneuerungen abgestorbene Zellen (Haut, Schleimhaut, Blutzellen) zuständig
Multipotent: können nur bestimmte Gewebetypen bilden
Embryonale Stammzellen
IPS-Zellen
Im Inneren der Blastozyste
Pluripotent: können sich zu jedem Zelltyp des Organismus entwickeln
Zellen, die durch Virus Fähigkeit zur Stammzelle erhalten
Therapeutisches Klonen
Verfahren zur Gewinnung von imunkompartiblem Gewebe
Embryonale Stammzellen werden aus einem adulten Zellkern gewonnen; setzt man in entkernte Eizelle ein
Krebstherapien
- chirurgische Entfernung des Krebsgewebes
- Strahlentherapie ->Zellen zerstört
- Einsatz von spezifischen Medikamente ->wirkt an krebstypischen Stoffwechselwegen (geringe Nebenwirkungen)
Bsp. für Medikamente: Mitosehemmer: Taxol: bindet an Mikrotubuki, stabilisiert sie, verhindert Abbau, dadurch kann Teilungszyklus nicht beendet werden, Apoptose wird eingeleitet; Zellteilung wird verhindert: Zytostatika
Andere binden an DNA und verhindern Replikation, andere erwirken DNA-Brüche
Zytostatika können aber nicht zwischen gesunden und Tumorzellen unterscheiden
Epigenetik
- Konkordanz
- postzygotische
- präzygotische Einflüsse
Vererbbare Veränderungen des Genaktivität
Kein Erbmaterial geht verloren, keine Erbmaterial verändert
DNA-Methylierungen (CH3-Gruppe) der Base Cytosin, häufig in Nachbarschaft von Guanin (CpG-Orte)
CpG-Inseln: entweder (fast) alle oder keine/wenige Methylierungen
Spezifische Proteine können sich an Methylierungen hängen, der Weg der RNA-Polymerase ist versperrt
durch Umwelteinflüsse/Gene dort angelagert werden; erzeugen Expressionsmuster; Methylierungen bleiben nach Zellteilung erhalten und werden auch an Tochterzelle weitergegeben
Konkordanzwerte: Gleichartigkeit hinsichtlich der Ausprägung eines Merkmals bei Zwillingen
Postzygotisch: epigenetischer Einfluss der Lebensweise der Mutter während Schwangerschaft auf genomische Prägung des Embryos
Präzygotisch: Umwelteinflüsse während der sensiblen Phase der Geschlechtszellreifung der Eltern; wirken auf spätere Entwicklung der Kinder
Histon-Modifikation
Lagert sich Methyl an die Histone, werden sie dichter zusammengepackt können nicht abgelesen werden, nicht transkribiert werden
um sie zu aktivieren und abzulesen muss sich Acetyl binden
Klone und transgene Tiere
klonen = künstliche Erzeugung identischer Lebewesen oder Pflanze
Transgene Tiere: Tiere weisen zusätzlich zu natürlichen vererbten Gene ein oder mehrere Fremdgene im Genom auf
Embryosplitting:
Trennung eines 16-zelligen Embryos zur Erzeugung eines Klons
Eizellenkerne werden entfernt und mit Nucleus des Spermas ersetzt
Klonierung durch Kerntransfer:
Duplikat eines adulten Schafes aus einer differenzierten Körperzelle
Euterzellen des genetischen Mutterschafs werden in nährstoffarmen Medium isoliert; Zellen stellen Teilung ein
-Eizelle wird entkernt und isolierte Zellkerne werden eingesetzt
-Zelle, die sich (im Idealfall) zu einem mehrzelligen Embryo weiterentwickelt hat, wird in Ammenschaf eingesetzt
-Lämmer sind Klone des Kernspenders
Gene-Pharming: (zur Herstellung von Arzneimitteln mithilfe transgener Nutztiere /-pflanzen)
AAT-Mangel: Erkrankung in Lunge und Leber
-menschliches AAT-Gen wird Schaf entnommen
-Fusionsgen wird in Schafzygoten übertragen wenn sich die beiden Zellkerne noch nicht vereint haben, wird an eine gekoppelt, In-vitro kultiviert und in Ammenschaf eingesetzt
-transgene Tiere entwickeln sich normal, Pflanzen sich fort und erzeugen Milch mit AAT
Vorteile: -Zellen vermehren sich schnell und unbegrenzt
- Erhaltung von Tierarten
- unfruchtbaren Paaren werden Babys ermöglicht
Nachteile: -ethische Bedenken
- massenhaft Embryos verbraucht
- auffällig für Krankheiten und Missbildungen
- höhere Sterberate
DNA-Chips
-Genomscanning
Herstellung: Glasplättchen, das in Felder unterteilt ist
In jedem Feld spezifische einzelsträngige DNA-Sonden auf dem Glas befestigt
Vorgang ähnelt Tintenstrahldrucker
Punktmuster auf Glasplatte
Genanalyse: -PCR-Produkte ausgewählter Gene werden mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert und in Einzelstränge denaturiert
->auf DNA-Chip
-Fragmente, die komplementär zu einer DNA-Sonde sind, hybridisieren
mithilfe von einer Software entsteht Muster, mit Computer analysiert
Transkriptionsanalyse: Genom vieler Krebszellen zeigt spezifisches Expressionsmuster
für Untersuchung wird mRNA aus gesunden Zellen und Krebszellen isoliert, mithilfe der Reversen Transkriptase mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert
beide zusammen auf DNA-Chip gegeben
Hybridisierungsmuster zeigt Farben (z.B. grün für gesunde, rot für Krebszellen, gelb wenn sie hybridiseren)
–>Entwicklung von Medizin und Früherkennung von Krebs
Untersuchung des gesamten menschl. Genom auf genetische Krankheiten wie Diabetes, Alzheimer, Herzinfarkt
Prognosen für zukünftige Erkrankungen; frühzeitige Vorsorge
Ethische Probleme: “genetische Diskriminierung”
DNA-Sequenzierung
Sanger-Sequenzierung: Denaturierung der DNA zu Einzelsträngen, mit Primern, DNA-Polymerasemolekülen, dNTP und ddNTP versetzt
Primer lagern sich an und DNA-Polymerase synthetisiert komplementären Strang
Wird ddNTP eingebaut = Kettenabbruchmethode; Synthese wird gestoppt
Mittels Elektrophorese der Länge nach sortiert
Laserstrahl regt Markerfarbstoffe an, Fluoreszenzlicht wird Base zugeordnet
Shotgun-Methode: ungerichtete Fragmentierung der DNA durch Restriktionsenzyme
Gelelektrophorese
Agarosegel wird mit Pufferlösung präpariert
DNA-Stränge werden durch Restriktionsenzyme in Bruchstücke verschiedener Länge zerteilt und in die Probenauftragstaschen gegeben
Elektrische Spannung wird angelegt; Fragmente wandern zur Anode
Kleine DNA-Stücke sind schneller, ordnen sich der Länge nach an
DNA wird angefärbt und im UV-Licht sichtbar, Banden entstehen
DNA mit bekannter Länge als Vergleich =>Rückschluss auf Anzahl, Reihenfolge, Abstand zwischen den Restriktionsenzymen
Anlegung von Restriktionkarten
Ein-Gen-Ein-Enzym-Hypothese
Ein-Gen-ein-Transkriptionsprodukt
Jedes Gen ist für Synthese eines Gens zuständig
Da nicht alle Produkte von Genen zur Herstellung von Polypeptiden führen musste Hypothese modifiziert werden
DNA-Reparationsmechanismen
Fehlpaarungsreparatur: beseitigt falsch eingebaute Basen und ersetzt sie mit den richtigen
DNA-Polymerase übernimmt Korrekturlesen an der Vorlage des Matrizenstrangs; stößt es auf ein falsch gepaartes Nucleotid, ersetzt es es durch das richtige fährt dann mit Replikation fort
Mismatch-Reparatur: Fehler durch fehlerhafte Korrektur; entstehen erst nach Vollendung der Replikation,…
Spezielle Enzyme werden von Zelle eingesetzt, um falsch gepaarte Nucleotide zu entfernen
Excisionsreparatur: DNA-Stück, welche Schadstelle enthält (durch Umwelteinflüsse oder reaktiven Chemikalien aus Zellstoffwechsel) wird durch Reparationsenzym herausgeschnitten, Lücke wird entsprechend der Basensequenz im komplementären Strang mit Nucleotiden aufgefüllt (DNA-Polymerase und -Ligase
Methoden zum Alternativen Kinderkriegen
Künstliche Insemination : mithilfe Katheters wird Spermienzelle in Eizelle injiziert, wenn Wahrscheinlichkeit für ein Empfängnis am größten ist
Homolog: eigener Partner
Heterolog:fremder Spender
In-vitro-Fertilisation: Reifung mehrerer Follikel gefördert durch FSH
Durch Bauch- oder Scheidenwand durch Punktion entnommen
Spermienzellen werden untersucht und dann mit Eizelle in Kulturmedium vermischt
Für zwei (manchmal 5) Tage in Brutschrank kubiert, im Blastozystenstadium werden 2 bis 3 Embryonen in Gebärmutter überführt (Embryotransfer)
Intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI): Eine Spermienzelle wird mit Mikromanipulator direkt in die Eizelle injiziert; wird angesaugt und so fixiert, Spermienzelle wird mithilfe der Kanüle hineingeschoben: funktioniert häufig nicht, da häufig Spermienzelle ausgesucht werden, die normalerweise gar nicht zur Eizelle gekommen wären; komplizierte Wechselwirkungen vor der Befruchtung außer Kraft gesetzt
MESA: Spermienzellen werden aus Nebenhoden angesaugt
PID (Präimplantations-Diagnostik): Genotypanalysen an Embryos; Möglichkeit nur ausgewählte Embryos mit spezifischen Merkmalen in die Gebärmutter einzupflanzen
Gewebetransplationen
IPS-Zellen
Therapeutisches Klonen
Blastozyste wird in Nährmedium kultiviert, Freilegung des Embryoblast durch Entfernung des Trophoblast und Teilung in kleinere Zellhaufen durch Chemikalien
Aus jedem Zellhaufen entsteht eine Zellkolonie
(Spezifische) Differenzierungsfaktoren werden hinzugegeben und es wachsen Zellen bestimmter Gewebetypen heran; als Ersatz transplantiert
Nachteil: Immunverträglichkeit (embryonale Stammzellen eines fremden Spenders)
Nur mit Einnahme von Medikamenten nicht abgestoßen
IPS-Zellen (induzierte pluripotente Stammzellen): mithilfe eines Virusvektors werden 4 spezifische Gene in Hautzellen eingeschleust
-Gene übernehmen Kontrolle über Hautzellgenom =>Reprogrammierung; einige Zellen verhalten sich so ähnlich wie embryonale Stammzellen und konnten sich zu verschiedenen Zellen differenzieren
=>keine ethischen Bedenken
=>keine Probleme mit Immunkompatibilität
3) Entnahme einer Gewebeprobe aus der Haut und eine reife Eizelle einer Spenderin
Kern der Eizelle wird durch Kern der Hautzellen ersetzt
Eizelle wird durch elektrische Impulse aktiviert und teilt sich
Blastozyste entwickelt sich nach mehreren Tagen
Trophoblast wird durch Laserstrahlen zerstört und pluripotente embryonale Stammzellen werden freigesetzt ->Kultivierung
Differenzierungsfaktoren werden hinzugegeben, entwickeln sich zum gewünschten Zelltypen
Immunkompatibilität gesichert, da Zellkern der Eizelle ersetzt wird
Krebs
Entstehung eines Tumors:
Mutationen im Erbgut einzelner Zellen; Zellen teilen sich unkontrolliert, bilden Wucherungen, die das gesunde Gewebe verdrängen; Beschwerden, da diese Zellen auch ihre normale Funktion verlieren
So lange die Zellen zusammengeballt bleiben, ist es ein gutartiger Tumor, kann chirurgisch entfernt werden
Lösen sich einzelne Zellen, können sie sich über die Blut- und Lymphgefäße im Körper ausbreiten; wachsen in anderen Geweben zu Metastasen (Tochtergeschwülsten) heran ->bösartiger Tumor
gesunde Zellen teilen sich in einem Organismus nur unter bestimmten Bedingungen (Kontexten); Zellzyklus und somit Häufigkeit und Zeitpunkt der Zellteilungen unterliegt einem komplexen Steuerungssystem
Mutation im Ras-Protein und p53
mutiertes Ras verliert seine Fähigkeit, gebundenes GTP zu spalten, dauerhaft in aktivierten Zustand ->Ras-abhängiger Transkriptionsaktivator ebenfalls permanent aktiv, Genexpression von z.b. den Cyclin-Molekülen kann nicht mehr gestoppt werden
mutiertes Ras =Onkogen (Gene, deren Genprodukte die Zellteilung übermäßg anregen)
p53: dauerhaft angeregt, erkennt noch das Signal, dass die DNA beschädigt ist, kann aber nicht mehr als Transkriptionsaktivator an die Ziel-DNA binden; p21 kann nicht transkribiert werden und DNA-Replikation wird trotz Schäden eingeleitet
intaktes p53-Protein: Tumor-Suppressorgen
ein Defekt vererbtes BRCA1 oder BRCA2-Allel (Tumor-Suppressorgene) kann Krebsrisiko erhöhen
Kontrollsystem des Zellzyklus
Drei Kontrollpunkte:
G1: Signale werden verarbeitet, die eine Zellteilung auslösen
Ohne Signale geht die Zelle in G0-Phase; Zelle muss gewisse Größe und Plasmamenge erreicht haben, mit ausreichend Enzymen und weiteren Proteinen und unbeschädigter DNA
G2: DNA muss vollständig repliziert sein
Metaphase-Kontrollpunkt: Kontrolle, ob alle Chromosomen an den Spindelfaserapparat angebunden sind
Cycline und Cyclin-abhängige Proteinkinasen (Cdk) für Kontrolle verantwortlich
Aktivität dieser Proteine entscheidet über Fortsetzung oder Unterbrechung des Vorgangs
Cycline = Aktivierungsproteine, die an Cdk binden
Unterliegen ständigen Auf- und Abbau
Die mitotischen Cycline binden während G2-Phase an die Cdk-Moleküle, bilden den Mitosephase-Förderfaktor (MPF)
Bei Spaltung von ATP wird Phosphat angelagert; Abbau von mitotischen Cyclin am Übergang zwischen Metaphase und Anaphase inaktiviert MPF
G1-Cyclin koppelt während G1-Phase an ein Cdk-Molekül, bildet Start-Kinase (löst DNA-Replikation aus)
Inaktivierung der Start-Kinase durch Abbau von G1-Cyclin
=>periodische Zusammenlagerungen, Aktivierungen und das Auseinandergehen von Cyclin-Cdk-Komplexen die zentralen Ereignisse, die den Zellzyklus am Laufen halten
Bildung dieser Komplex wird wiederrum gesteuert von Signalen aus der Umgebung, die in den Zellen verarbeitet wird und somit den Zellzyklus beeinflussen
Signalübertragung durch Ras und p53
Signale aus Umgebung regulieren das Fortschreiten des Zellzyklus
Ras-abhängiger Signalweg: Ras ist ein Membran-assoziiertes GTP-bindendes Protein; liegt zunächst in einer inaktiven GDP-bindenden Form vor
Membranrezeptor empfängt extrazelluläres Signal ->Konformationsänderung ->Phosphorylierung des Rezeptors ->Ras-GDP bindet an phosphorylierten Rezeptor ->Ras-Protein wird in eine aktive Form überführt; GDP = GTP
das aktivierte Ras setzt eine Signalkaskade in Gang; am Ende steht Aktivierung eines Transkriptionsaktivators; Genexpression wird eingeleitet , Genprodukte werden für Zellteilung benötigt ; Ras wird durch Spaltung des gebundenen GTPs in GDP und Phosphat inaktiv
p53: inaktiv; Meldung über DNA-Beschädigung erwirkt Aktivierung, in dieser ist p53 ein Transkriptionsaktivator, leitet Transkription der mRNA für p21 ein
p21 = Inhibitor der Start-Kinase; lagert sich an diese und hemmt sie so; DNA-Replikation wird hinausgezögert, DNA-Schäden können repariert werden
Lysogener und lytischer Zyklus
Lysogener: Vermehrungszyklus
1) Adsorption an Bakterium
2) Injizieren der linearen DNA der Phage
3) Leere Hülle bleibt an Zelloberfläche zurück
4) Phagen-DNA schließt sich durch Verknüpfung der kohäsiven Enden zu einem Ring
5) Wird in Bakterien-DNA eingebaut; eingebaute Virus-DNA heißt Prophage
Bei jeder Zellteilung wird Virus-DNA zusammen mit Bakterien-DNA verdoppelt, an Tochterzelle weitergegeben
Lytischer Zyklus:
- Phagengenom aus Bakterien-DNA herausgelöst
- DNA wird in festgelegter Reihenfolge abgelesen, Virus Bausteine werden im Zellinneren separat produziert (Virus-DNA durch Replikation vervielfältigt)
- einzelne Virus Bausteine finden von selbst zu neuen Phagen zusammen ->selfassembly
- wenn ca 200 Phagen gebildet wurden, wird Enzym Lysozym synthetisiert
- löst Bakterienzellwand auf, Bakterium platzt und Phagen werden freigesetzt
Genetischer Fingerabdruck
Genetischer Fingerabdruck ist ein für jedes Individuum einzigartiges Profil, welches mit Hilfe molekularer Marker erstellt wird, anhand dessen die Person wie durch ihren Fingerabdruck identifiziert werden kann
RFLP-Analyse
Minisatelliten: -genetische Information ist in allen Zellen des Körpers identisch
-Untersuchungen der Introns ->viele Mutationen; Polymorphismen = indiviuelles Muster durch VNTRs (Variable Number of Tandem repeats)
-DNA wird durch Restriktionsenzyme in verschieden lange Stücke geschnitten; Länge ist von Person zu Person unterschiedlich (RFLP)
Southern-Blotting:
- DNA durch Gelelektrophorese der Größe nach aufgetrennt
- DNA wird denaturiert
- Schwamm, Gel, Nitrozellulosefilter, Papiertücher und Gewicht werden in Pufferlösung platziert
- durch Kapillarkräfte wird Pufferlösung durch Gel und Filter nach unten gesogen ->Übertragung der DNA-Fragmente auf Filter
Autoradiographie:
- Filter wird mit radioaktiver Sonde inkubiert
- einzelsträngige DNA-Sequenz mit komplementären Sequenzen einzelner DNA-Abschnitte hybridisiert; Markierung einzelner Abschnitte
- nach Entfernung überzähliger Sonden wird Röntgenfilter auf Nitrozellulosefilter gelegt, auf de Film sind schwarze Balken an den Stellen zu erkennen, wo auf dem Filter Sonden gebunden waren
Mikrosatetelliten (STRs):
- Introns
- andere Gruppe von Sequenzen als Marker
- PCR zur Vervielfältigung
- Fragmente in Gelelektrophorese
es entstehen Peaks, die verglichen werden und dann zur Identifizierung und Verwandtschaftsbestimmung genutzt werden
Hemizygotie
X und Y Chromosom bei einem Mann hemizygot, da Y nicht gleichwertig und fast genleer ist; sind nicht homolog