Homologous Recombination Flashcards
(36 cards)
Hva er rekombinasjon?
Fysisk endring i DNA sekvens mellom kromosomer
Når er rekombinasjon nødvendig?
- Reparere double-strand brudd
- Meisose
- Stor bidrager for genetisk variasjon
- Kontrollere genekspresjon
- Genetisk knock-outs
- Transgenetikk
- Kreft behandling
- Basis i forskjellig teknologi
Hva fører til double-strand brudd (DSB)?
- Stråling: spes skadelig siden de er vanskelig å reparere.
- DNA replikasjon:
• Nick i templat gir DSB ved repl.
• Lesion i templat kan føre til stop i replikasjonsgaffelen som kan gi DSB
Hvilke 5 nøkkel steg er det i homolog rekombinasjon?
- Alignment av to homologe nesten identiske DNA molekyl.
- Introduksjon av brudd i DNA som videre blir prosessert til ssDNA.
- Strand invasjon, ved baseparing mellom to rekombinerende DNA.
- Dannelse av Holliday junction, et junction (kryss) som kan beveges ved branch migration.
- Resolution av Holliday junction, regenerer seperate DNA molekyler.
Hva er heteroduplex?
Det er når sekvense er forskjellige etter rekombinasjon. Feks vi har allene AA og aa, rekombinasjon -> Aa, da er Aa heteroduplex.
Hva forrårsaker strand invasjon?
Base paring mellom to ulike molekyler.
Hva kan skje med stranden ved DSB i strand invasion?
DSB lar en strand bli «peeled off» og flytte over til det andre DNAet.
Hvilke to utkom kan skje ved oppløsning av Holliday junction?
- Kutting i reint parental strand -> ett overkryss produkt, de to DNAene er «spliced» sammen
- Kutting i mikset strand -> ett ikke-overkryss produkt, kun ett segment av DNA er vekslet
Hva har oppløsning/kløyving av Holliday junction å si for om man får overkryss eller ikke?
- Om begge junctions er kløyvd på samme vis (samme sete), vil man ikke få overkryss produkt.
- Om begge junctions er kløyvd på ulikt vis (ulike sete), vil man få overkryss produkt.
Hvordan kan homolog rekombinasjon bli brukt for å reparere DSB?
- Introduksjon til brudd som blir videre prosessert til ssDNA med 3’-hale.
- Strand invasion og baseparing
- Andre strand invasion, etterfulgt med DNA reperasjon syntese i 3’-enden.
- Dannelse av to Holliday junctions, junctions som kan beveges ved branch migrering.
- Oppløsning av Holliday junction - regenerer seperate DNA molekyler.
Hvilket enzym (E.coli) blir brukt for å prosessere endene ved strand invasion for å generere 3’-ender i DSB?
- RecBCD
- Gjør endene klare til å bli strand invadert. Hjelper å loade RecA.
- Inneholder 3 subenheter, med helicase og nuclease aktivitet.
- Bruker ATP
Hvilke subenheter i RecBCD har helicase aktivitet?
- RecB, 3’-5’ helicase aktivitet, begynner ved 3’-enden og beveger til venstre. Er sen (i starten)
- RecD, 5’-3’ helicase aktivitet, begynner ved 5’-enden og beveger seg til venstre. Er rask (i starten)
- Beveger seg i samme retning
Hva er χ (chi) setet?
- χ er crossover hotspot instigator
- Har sekvens GCTGGTGG
- Styrer hastigheten til RecD og RecB ved at hastighet differansen mellom RecD og RecB blir mindre.
RecD blir senere enn RecB. - RecB slutter å bryte ned 3’-ender.
Hvilken subenhet gjenkjenner χ?
RecC
Hvilken subenhet i RecBCD har nuclease aktivitet?
- RecB
- RecB degraderer begge strands, men med ulik effektivitet.
Hva er resultatet etter RecBCD?
Et langt ssDNA som stikker ut med Chi (χ) på 3’-enden.
Forklar mekanismen til RecBCD komplekset.
- RecC møter og gjenkjenner Chi på 3’ strand.
- RecC signalerer den raskere RecD til å stoppe.
- Når stoppet, RecD signalerer RecB til å kutte DNA ved Chi og
- Begynner loading av RecA protein til den nye genererte 3’-enden med Chi.
Hvorfor er Chi sete nødvendig?
- Øker rekombinasjonsraten 10-fold.
Hva skjer med DNAet mellom DSB og Chi?
- Det blir degradert, og derfor mistet.
- Etter Chi, er det ikke noe degradering.
Hva gjør RecA?
- RecA danner filament på ssDNA før det reagerer med en homolog duplex.
- Produktet er en heteroduplex DNA med strand veksling.
- Filamentet som dannes, inneholder RecA som tvinnes rundt DNA. DNA som er i filamentet blir strukket 1.5x lineært.
Hva er RecA?
- RecA tilhører en familie protein, kalt strand-exchange proteins, som katalyserer paring av homologe DNA molekyl. Dette involverer søking+parring.
Hva er viktig med RecA filamentene?
- De dekker 3’-enden på ssDNA med RecA -> RecA-ssDNA filament initierer et søk på homologi -> søk på homologi mellom ssDNA og nytt dsDNA.
Hvordan er mekanismen ved homologi søk? Altså i RecA
- ssDNA bindes til det primære bindingssetet.
- dsDNA bindes svakt til sekundært bindingssete for komplementæritet.
- Et komplementær match av >= 15bp utløser strand utveksling.
- Ved komplementæritet, vil baseparing ta plass.
Hva er RuvAB komplekset?
- Det er protein kompleks som gjenkjenner Holliday junction og som inngår i branch migrering.
- Består av to proteiner: RuvB og RuvA.
