Jaenette Nilsson - Metoder I-II Flashcards
Rekombinant
En DNA molekyl där man har satt ihop olika DNA från olika ursprung.
Restriktionsenzym
Bildas av bakterier för att skydda sig mot virus. Restriktionsenzymet klipper DNA vid specifika igenkänningssekvenser. På igenkänningssekvenserna i bakteriens egna DNA sitter metylgrupper som skyddar det från att bli klyvt.
DNA ligas
Kan sätta ihop två DNA fragment, även in vitro.
Gelelektrofores
Prover klyvs och läggs i brunnar i gelen. De olika fragmenten kommer vandra olika långt beroende på storlek, de mindre fragmenten vandrar längst. För att se banden använder man ett ämne som binder till DNA och fluorescerar.
Gelelektrofores ger info om:
- hur många fragment man får efter klyvning.
- storleken på fragmenten.
- hur mycket det finns av varje fragment (intensiteten på banden).
Plasmidvektor
En dubbelsträngad, cirkulär DNA molekyl. En plasmid ska innehålla ett origin för replikering, en polylinker och selektionsmarkörer (tex antibiotikaresistens eller blåvit selektion).
Vad är PCR (polymerase chain reaction)?
PCR används för att kopiera specifika DNA molekyler när bara sekvensen i ändarna är känd. Det är en mycket känslig metod, vilket innebär att man behöver mycket lite utgångsmaterial. PCR används idag framför allt inom forskning, diagnostik och kriminologi.
Fyra olika typer av mutationer
- Point mutation: en kvävebas byts ut.
- Deletion mutation: ett kodon tas bort.
- Insertion mutation: ett kodon läggs till.
- Increased repeat mutation: en sekvens av två eller flera likadana kodon repeteras fler gånger.
DNA kloning
DNA kloning har två olika betydelser:
- att göra många identiska kopior av en DNA molekyl.
- att isolera en specifik gen ur arvsmassan.
Vad “innehåller” PCR?
PCR kräver:
- DNA-templat som innehåller målregionen som ska amplifieras.
- Två primrar som vardera är komplementära till 3’-ändarna på den kodande och den ickekodande strängen i templatet.
- Ett DNA polymeras (tex Taq) med temp. optimum vi ca 72 grader.
- De fyra baserna.
PCR tillvägagångssätt
- Initieringssteg om polymeraset kräver värmeaktivering. Upphettning till ca 95 grader.
- Denatureringssteg: vanligtvis det första steget i en cykel. Upphettning till ca 95 grader under 20-30 sek, vilket gör att DNA strängarna i templatet separeras.
- Hybridiseringssteg: temperaturen sänks till 50-65 grader i 20-40 sek. Detta gör att primrarna kan binda in.
- Förlängningssteg: temperatur beror på vilket polymeras som används. Allmänt 72 grader. DNA polymeraset syntetiserar en ny DNA sträng som är komplementär till templatet.
DNA sekvensering
Enkelsträngade DNA fragment fästs på en yta. Varje fragment amplifieras med PCR till ca 1000 st per platta.
DNA polymeras och de fyra baserna tillsätts. Alla baser är märkt med varsin fluorescerande molekyl. Det är bara en bas som kan byggas på under varje cykel, och de som inte byggs på tvättas bort. Fluorescensen av den inbyggda basen detekteras med kamera. Den fluorescerande taggen tas bort. Detta görs om 100-300 gånger.
Miljontalt DNA fragment sekvenseras- Med hjälp av en dator försöker man hitta överlappande sekvenser mellan fragmenten, vilket leder till en konsensussekvens.
Är gener kopplade till specifika sjukdomar?
Nej, istället beror sjukdomen oftast på att gener är muterade på olika sätt.
Positionskloning
Lokalisera gen som orsakar sjukdom. Startar med att lokalisera genen i genomet, därefter försöker man förstå proteinets funktion.
Funktionskloning
Hitta gen som orsakar sjukdom. Startar med proteinet som genen kodar för, och använder sig av detta för att hitta genen.
cDNA bibliotek
En blandning av rekombinanter som tillsammans innehåller alla de kodande delarna av de gener som var aktiva i vävnaden man utgick från.
Isolerat mRNA - reverse transcriptase into DNA - insert into bacterial plasmids - insert plasmids into bacteria - grow - isolate and purify DNA. Detta gör att man inte har några introner.
