Laboratorio 3: Determinación De Concentración De Proteínas Flashcards
(11 cards)
Menciona los 2 objetivos del laboratorio (se divide en 2 partes)
- Realizar una curva de calibración de proteínas por el método de Bradford
- Determinar la concentración de proteínas del extracto de invertasa.
Qué colorante se usa en el método de Bradford? Que carga y color debe tener?
El colornte coomassie Blue G250,el cual en su estado aniónico azul se une a proteínas.
Cómo funciona el método de Bradford?
El colorante En su forma anionica interactua con aminoacidos básicos cargados positivamente en la proteína, como lisina e histidina. El complejo colorante-proteína tiene una absorbancia máxima a 295 nm.
Por medio de una curva de calibrado se puede estimar la concentración de la proteína.
Qué reactivos se usarán?
- Solución estándar albúmina de suero bovino a 100 ug/mL.
- Reactivo de Bradford.
Qué rangos de concentraciones se usarán para la confección de la curva de calibrado?
Entre 15 ug/mL a 1 ug/mL
Cómo calcularías la concentración de albúmina de interés (3ug/mL por ejemplo) si el volúmen final será de 1mL?
C1V1=C2V2
100ug/mL * Valbúmina = Cquiero * 1mL
Valbúmina = (Cquiero * 1mL) / 100ug/mL
Cuantos tubos para espectrofotometría se usarán?
7 mas un blanco
Cuantas muestras usaremos para cuantificar experimentalmente su concentración?
2, la ALI 1 y ALI 2
Cuanto tiempo deberás dejar los tubos a temperatura ambiente antes de medir la absorbancia?
De 2 a 5 minutos.
Cuales compuestos interfieren en el método de Bradford y por qué?
- Moléculas que se unan al colorante como los detergentes.
- Moléculas que alteran la estructura química del colorante como agentes reductores, ácidos y bases.
Qué otro método usarías para determinar la concentración de proteínas?
El ENSAYO DE LOWRY, donde se usa el reactivo de Lowry formado por 2 soluciones:
- Reactivo Folin-Ciocalteu: Se reduce en presencia de grupos básicos de proteínas (sea R o N terminal), por lo que permite la formación de un complejo proteína-cobre.
- Solución de CuSO4: De aquí viene el cobre que formará parte de los complejos.
Se mide la absorbancia a 750 nm del complejo proteína-cobre.
