Mesure de l’activité enzymatique Flashcards
(15 cards)
Expliquez le phénomène de rétro-inhibition.
il faut que les vitesses mesurées soit linéaires, car lorsqu’il y a accumulation du produit (si enzyme transforme rapidement substrat en produit, il y a de moins en moins de substrat disponible) et la vitesse de réaction va diminuer car moins de substrat disponible
si produit s’accumule, celui-ci peut inhiber l’activité de l’enzyme, produit peut lier au niveau du site actif et empêcher la liaison du substrat et réaction enzymatique est moins élevée. (rétro-inhibition)
Nommez 5 stratégies pour éviter la rétro-inhibition.
- Mesurer la réaction enzymatique pour une courte durée afin de minimiser l’accumulation du produit 2.L’utilisation de hautes concentrations de substrat 3.Utiliser des pH non physiologiques (basiques si le produit de la réaction est un proton) pour enlever le proton et déplacer la réaction dans la direction de la formation du produit
- L’utilisation de méthodes très sensibles pour détecter le produit afin de minimiser sa concentration
- l’inhibition par le substrat à des hautes concentrations peut aussi être due à la formation d’interactions non appropriées au site actif et qui mènent à l’inhibition de l’activité enzymatique
Quels facteurs (3) influencent les valeurs de Km et de Vmax?
pH
force ionique (tampon)
température
Vrai ou faux : un tampon avec une affinité faible pour le substrat ne peut pas agir comme inhibiteur.
Faux, Puisque les concentrations de tampon sont souvent élevées, entre 10 et 100mM, même une association faible par le tampon peut provoquer une inhibition importante
vrai ou faux: La vitesse d’une réaction augmente en règle générale d’un facteur 4 pour chaque augmentation de 10°C
faux, La vitesse d’une réaction augmente en règle générale d’un facteur 2 pour chaque augmentation de 10°C
Si on augmente la température, on augmente la vitesse de la réaction des enzymes, alors pourquoi ne faut-il pas augmenter la température indéfiniment?
Parce qu’on risque de dénaturer les enzymes.
vrai ou faux:Plus la période d’incubation est courte, plus la température apparente de l’activité maximale peut être élevée
vrai, car laisse moins le temps à l’enzyme de se dénaturer
Lors d’une incubation par méthodes discontinues, que faut-il d’abord vérifier?
Que l’évolution de la quantité de produit en fonction du temps est linéaire
Nomme 3 méthodes qui provoquent la dénaturation instantanée de l’enzyme et arrêtent ainsi son activité dans la réaction.
1- précipitation par acide trichloracétique ou perchlorique
2- dénaturation thermique de l’enzyme
3- utilisation du SDS pour dénaturer l’enzyme
Nomme 3 méthodes non-dénaturantes qui inactivent l’enzyme. Dans quel cas faudrait-il utiliser ces méthodes?
1- changement de pH
2- ajout d’EDTA si des ions métalliques sont essentiels 3- dilution avec un substrat non-radioactif si un produit marqué par un isotope radioactif est mesuré
on utilise les techniques non-dénaturantes lorsque l’utilisation de techniques dénaturantes affecterait le produit, donc on sous-estimerait la quantité de produit
Lors de l’utilisation des méthodes discontinues, il est nécessaire de mesurer le produit obtenu. Nomme 2 techniques de détection utilisées fréquemment.
1- spectrophotométrie
2- fluorométrie
le but de ces méthodes est que la détection du produit final dépend de la production d’un chromatophore ou fluorophore important et qui est facile à détecter. (voir détection directe (où le produit obtenu est détectable par spectrophotométrie) ou indirecte (réactions couplées) si le produit obtenu n’émet pas ou n’absorbe pas de photons, enzyme utilise le produit de la première réaction pour le transformer en un autre produit détectable par spectrophotométrie)
vrai ou faux: les méthodes continues impliquent que le progrès de la réaction soit observé pendant toute la réaction et généralement de façon instantanée
vrai
Donnez un exemple d’une utilisation d’un essai couplé pour doser un produit.
glucose sanguin
Qu’est-il important de vérifier avant d’utiliser des essais couplés pour mesurer un produit? (détection indirecte)
Que la quantité de produit final obtenu (observable par spectrophotométrie) est directement proportionnelle (stoechiométriquement parlant) à la quantité de produit de la première réaction (qui n’était pas observable par spectrophotométrie.
Quelles sont les 3 catégories d’enzymes dont nous pouvons mesurer l’activité en méthode continue?
1- les déshydrogénases qui utilisent NAD ou NADP
2- les hydrolases qui peuvent utiliser des substrats synthétiques qui libèrent des produits colorés ou fluorescents
3- polymères endohydrolases qui par leur activité réduisent la viscosité d’un polymère
