Microbio appliquée

Question 1

Fabrication de fromages à pâte molle

Answer 1

1. Standardiser le lait en MG et protéine par écrémage par ex
2. Traitement thermique : pasteurisation
3. Ensemencé avec des bactéries lactiques
4. Coagulation par addiction de présure
5. Découpage à la louche, ou industriellement pour enlever le lactoserum (et donc le lactose).
   Influence de la vitesse. Plus le lactoserum s’en va vite, moins le produit sera acide.
6. Moulage du caillé, pH ~4-6
7. Lavage permet un affinage plus dans la masse et d’enlever le lactose, de bloquer le pH, les
   protéases agissent plus rapidement.
8. Retournements successifs
9. Égouttage, obtenir un pH final de 5,2
10. Salage en saumure (risque de contamination microbiologique) ou à sec.
11. Affinage : la croûte se forme à cause du développement de moisissure (acide lactique est
    consommé car plus de lactose, le pH remonte, les protéases détruisent des caséines, devient donc liquide -> camembert coulant).

Question 2

principe du moulage

Answer 2

= diminuer l’Aw.

Question 3

Produit laitier fermenté

Answer 3

pH acide et/ou Aw baissée → sélection de flores spécifiques qui inhibe la flore pathogène et modifie la MP ⇒ production de composés aromatiques +modification de la structure + modifications des propriétés nutritionnelles ⇒ conservation du lait + Élaboration d’un nouvel aliment.

Question 4

Lait microfiltré

Answer 4

= système de filtration sur colonne qui permettent d’enlever les bactéries sans chauffer le lait ⇒ X fromage lait cru.

Question 5

Affinage

Answer 5

rajout de MO ou MO présents dans environnement qui se multiplient sur fromage

Question 6

évolution du nombre de bactéries lors de la fermentation

Answer 6

(mélange biophilisés) 106/mL et ses bactéries se multiplient jusqu’à 109/g de caillé jusqu’à la fin. Les populations changent selon la spécificité.

Question 7

modifier les caractéristiques physicochimiques des fromages :

Answer 7

• maitriser baisse de pH en faisant couler rapidement ou pas le lactosérum (eau qui coule lorsque toutes les protéines sont coagulées). Si pas d’eau, les bactéries se multiplient bien donc produit acide. Caprice des Dieux : pour limiter la protéolyse ou du moins uniforme, on évite d’avoir une pâte trop acide, les protéases agissent partout. On enlève le lactosérum tout simplement en lavant le caillé.
• Accélérer l’égouttage (presser, à la louche, broyer les grains pour enlever l’eau).
• Maitriser l’Aw = couper le caillé en petits bouts, presser le caillé, le chauffer pour dénaturer les protéines ce qui va expulser de l’eau, au moment de la finage si on augmente le temps de ce dernier on diminue l’Aw ainsi qu’au niveau de la T° d’affinage.
• Maîtriser le potentiel rédox cad la présence en O2 (aération de la pâte) ; pour empêcher le développement des moisissures sur le roquefort = emballage (aluminium) pour éviter oxydation.

Question 8

Quelles sont les difficultés lorsqu’on essaye de relier la molécule et la flaveur ?

Answer 8

Il faut d’abord identifier le support puis repérer quelles sont les molécules susceptibles d’être importantes dans fromages puis voir quels groupes de souches susceptibles de produire ces produits.

Question 9

L’acidification est liée à une bactérie lactique

Answer 9

Lactococcus lactis. Elle possède l’opéron lactose qui permet entrée du lactose dans la cellule et sa dégradation en glucose + fructose puis en pyruvate. Puis enzyme lactate déshydrogénase qui permet de régénérer NADH2 en NAD+ et formation d’acide lactique à partir de pyruvate.
Acidification liée à la production de protons qui permet inhibition des pathogènes.

Question 10

conservation au froid du lait

Answer 10

permet le développement des bactéries psychrotrophe qui vont dégrader le lait, par ex les pseudomonasses

Question 11

La présure

Answer 11

permet enlève les propriétés hydrophiles des caséines, elles deviennent hydrophobes, elles vont alors se rapprocher -> gélification du lait.

Question 12

Impact sur la sélection et le développement de la flore microbienne

Answer 12

on peut plus ou moins maitriser la baisse de Ph. On enlève le lactoserum et on met de l’eau à la place.
o Utilisation d’espèces et souches plus ou moins acidifiantes
o Délactosage du caillé : lorsque l’on moule à la louche, on ne casse pas le caillé, on le garde intacte comme un flan.
o Accélération ou non de l’égouttage L’égouttage lent implique qu’on va laisser de l’eau dans le lait.

Question 13

Maitriser plus ou moins l’aw

Answer 13

on fait en sorte qu’il y ait plus ou moins d’eau.
o Au niveau de la préparation du caillé : Découpage, moulage, brassage, cuisson,
broyage, salage …
o Au niveau de l’affinage :
§ Le temps d’affinage : plus ils sont affinés longtemps, plus ils sont durs et goûteux.
§ Variation de la T° d’affinage : si on veut des trous, on augmente la T°.

Question 14

Potentiel rédox

Answer 14

on peut limiter l’oxygénation des produits
Ex Pour le roquefort : pas de croûte, car enveloppé dans une feuille d’alu pour empêcher l’oxygénation du produit en surface. Ces moisissures sont la plupart du temps aérobie, donc on aurait un développement extrêmement rapide et les fromages seraient immangeables. Pourtant les moisissures se développent à l’intérieur car on trou le caillé avec des longues aiguilles.

Question 15

Acidification et coagulation des protéines

Answer 15

® Production d’acide lactique par Lactococcus lactis : lactose est dégradé en pyruvate pour être transformé en acide lactique par la lactate DH, avec formation de NAD+.
Une influence sur le lait : change les charges des micelles des caséines, elles vont atteindre le point isoélectrique, et vont devenir insolubles -> elles coagulent, et permet de diminuer l’Aw et le pH.
Cela permet d’inhiber les pathogène et de sélectionner une flore acidotolérante.
® À 6,2 on ajoute de la présure, qui coupe la caséine k, les micelles deviennent hydrophobes. On
a formation d’un gel.
® Si on laisse le pH diminuer, la structure des micelles changent, les micelles ne sont plus
chargées – mais – et +. Le calcium part avec le lactosérum.

Question 16

Rôle dans l’affinage

Answer 16

dégradation des protéines et des lipides.
® Les protéines sont dégradées par des protéases en peptides, qui peuvent rentrer dans la cellule. Puis les endopeptidases coupent les peptides en petits bouts. Les aa qui résultent de cette dégradation vont être aussi utilisés : transamination, décarboxylation …
® Les TG sont dégradées par des lipases, puis transformés en beaucoup de molécules genre aldéhydes.
Les AGL à chaînes courtes ont un seuil de perception jusque 10000 fois plus faible que ceux à chaînes longues.
Le développement des flores d’affinages dépend du pH, Aw, substrat, O2, CO2, T°, temps, technologie, flores.

Question 17

Fromages pâtes pressées cuites

Answer 17

on rajoute des lactocoques pour préparer le lait pour garder un redox assez bas et réduire l’O2 pour faciliter l’action des thermophiles, et produire quelques peptides et aa. L’acidification est alors plus rapide au moment du pressage. Les lactobacilles prennent le relai de l’acidification. Au démoulage, plus de lactose, mais encore du calcium, moins acide. Quand on démoule, la phase de salage : saumure ou en surface. En conté, on utilise un sceau : sel et populations énigmatiques : la morge (des vieux fromages aux jeunes). L’affinage à froid à supprimer les bulles, mais permet de standardiser et de maîtriser la fabrication.
Ils sont moins acides car égouttage ++ dû à la cuisson et presse ⇒ il n’y pas d’étape de délactose. Le calcium est enfermé dans matrice avant acidification donc part beaucoup moins dans lactosérum que pour fromages à pâte molle.
Une fois le produit démoulé, phase de salage qui peut s’opérer soit sous forme saumure soit ne surface (seau avec morge + sel). Les populations d’affinage croissent alors qui sont hétérofermentaires. Affinage à froid pour mieux maîtriser l’affinage.

Question 18

Selon types de croûtes, MO ou non ?

Answer 18

Fromages à croûte lavée (levures, microcoques, corynébactéries) croûte moisie (moisissures, levures) et à pâte sèche = ø, croûte morgée (beaufort) = corynbactéries, levures, microcoques.

Question 19

Fabrication du saucisson sec

Answer 19

Préparer le maigre = viande cru avec peu de gras
Broyage avec ajout de sel (diminuer l’Aw) + salpêtre (minéral = nitrates pour se transformer en nitrites qui vont se lier à l’hémoglobine → inhibe clostridium + donne couleur) + sucres (pour développement des bactéries).
Préparation du gras avec ajout de sel (30g/kg) à 1°C pour éviter que le gras ne fonde.
Puis on mélange les 2 (30 à 35% gras et 60 à 65% maigre).
Staphylocoques (réduire nitrates en nitrites + protéolyse), lactobacilles (acidification) et pediococcus.
Il faut mettre 106 MO/g au début (si trop peu, prend trop de temps pour fermenter) et on atteint 109 MO/g en fin de fermentation.
Enfin embossage = faire rentrer le mélange dans les boyaux.
Étuvage = 30-35°C pendant 18h à 3 jours où il perde 10% du poids, pH augmente et passe couleur brune à rouge.
Séchage et maturation et affinage → 10-15°C pendant qqs semaines à plusieurs mois ⇒ ↘ 30% du poids + lipolyse + protéolyse.
Finition et brossage

Question 20

Les rôles de la flore du saucisson

Answer 20

® Bactéries lactiques : acidification, arômes, texture, bactériocines
® Staph : couleur, flaveurs (inhibent l’oxydation des lipides et molécules issues des aa et ag),texture
® Moisissures : protège en surface de l’O2, de la lumière, de la dessiccation, arômes.

Question 21

Batch

Answer 21

préparation d’une culture, ensemencement, on attend que MO se développent et on les récupère eux ou soit ce qu’ils ont produit. Le milieu de culture est stérilisé, cad l’enceinte est chauffée pour tuer tous les MO.
Lorsqu’on produit des molécules, il fat éviter la présence d’O2 pour processus de fermentation. Entrée d’eau réfrigérée car réactions de multiplication exothermiques.

Question 22

Quelles sont les difficultés dans un fermenteur ?

Answer 22

Quand on veut cultiver un MO dans fermenteur pour ne faire produire des métabolites il faut maitriser le milieu de culture, le pH, l’agitation, la T°, l’aération. Au sein d’une même espèce microbienne, souches différentes qui ne vont pas toutes secréter les molécules souhaitées. Si on veut faire culture à pH neutre, au cours fermentation acidification il faut donc réguler pH (soude, ammoniac) mais la consommation de régulateur se fait surtout pendant phase exponentielle de croissance.

Question 23

Contraintes au niveau du milieu de culture

Answer 23

on utilise peptones (source d’azote) ou sucres (glucose, saccharose) et pour optimiser contraintes technologies de séchage, prix.
Plus d’un an de travail pour travailler sur des milieux de culture + appropriés.

Question 24

Fermentation continue

Answer 24

évacuer au fur et à mesure de la fermentation le milieu avec les MO, les séparer du milieu (si n veut récupérer les MO pour produire un levain de bactéries lactiques en fromagerie par exemple) ou récupère le surnageant si on a produit une molécule via le MO.
Faire rentrer du milieu frais en continue et récupérer les MO et le milieu « épuisé » en continu. Problème : il peut y avoir des contaminations car on ajoute au fur et à mesure du milieu de culture.
Avec recyclage de la biomasse : même principe sauf que cette technique permet de garder les MO (microfiltration ou ultra) ce qui permet d’évacuer les molécules produits par les MO mais garder les MO et les réinjecter dans le fermenteur → moins perte d’énergie.

Question 25

La fermentation en milieu solide surtout utilisée pour

Answer 25

les moisissures car pas tjrs facile de cultiver moisissures en milieu liquide car toujours aérobie. On les cultive donc sur des plateaux où il y a des milieux de cultures. Fermentation en aérobie.

Question 26

➢ Qu’est-ce qu’un MGM ?

Answer 26

bactérie (levure en général) ou champignon dans lesquels on a transféré un gène et pour que ce dernier soit répliqué il est associé à un vecteur de colonage (hétérologue cad autre espèce ou provenir d’un autre MO comme une plante, animal ou l’homme → ex : clonage de l’insuline chez E.coli) ou gène homologue (souche de la même espèce). Ces MGM peuvent être améliorés si on insère le gène sur le chromosome car on peut supprimer vecteur de clonage car ADN tjrs étranger et qui peut posséder des gènes R aux antibio et qui nécessite pour que gènes soient conservés d’effectuer une pression de sélection par l’antibio lorsqu’on cultive le MO. Si insérer sur chromosome pas besoin de faire pression de sélection. Le gène est inséré à un endroit bien connu.

Question 27

➢ Les antibiotiques et mode d'action

Answer 27

Les antibio agissent à différents niveaux de la bactérie. Au niveau de la paroi cellulaire (pénicilline et dérivés) mais aussi au niveau de le réplication de l’ADN, au niveau de la transcription, mais aussi au niveau de la synthèse des protéines. La grande majorité de ces antibios est produite par une bactérie (streptomyces = filamenteuses qu’on retrouve dans le sol).

Question 28

qui produit les antibio

Answer 28

Les antibiotiques sont produits naturellement par les MO, pas besoin de modifier le génome des Mo pour en produire. Cependant, on peut modifier les antibios pour modifier leur spectre d’action. Ex : pénicilline, si on change la chaine latérale, on obtient ≠ types d’antibio. La production d’antibio dure 6-7 jours en fermenteurs. Molécules ont certain coût.

Question 29

découverte de nouveaux antibios

Answer 29

Recherche de nouveaux antibiotiques sur des nématodes. Mort de l’insecte par largage de toxines puis Production d’une variété de molécules antibiotiques (préservent le cadavre de l'insecte de leurs compétiteurs microbiens puis décomposition de l’insecte par la bactérie qui y trouvent des nutriments et enfin infections d’autres nématodes durant leur formation dans l’insecte.

Question 30

production d'AB par hémi-synthèse

Answer 30

Alternance entre des étapes microbiennes et étape chimiques : la cortisone. Le coût de la cortisone a énormément ↘ depuis qu’on a commencé la produire à partir de 2 MP : la racine de barbasco et un sous produit de l’industrie du soja. Étapes chimiques où on modifie les molécules + étapes où ces molécules vont être introduites dans un fermenteur où il y aura des modifications par MO. Les 2 sont rhizopus et curvularia. Étapes chimiques : le stéroïde dissout dans l’acétone est ajouté à la culture de Rhizopus, transformation d’un groupement alcool en cétone. Étapes microbiennes : hydroxylation microbienne, déshydrogénation.

Question 31

- les vaccins atténués

Answer 31

on a pris l’agent pathogène et on sélectionné des souches qui étaient atténuées. Plusieurs méthodes pour atténuer la violence d’une souche : prendre le virus dont on veut le vaccin et le multiplier sur une autre espèce (on modifie alors sa spécificité d’espèce → ce MO ne se multipliera pas mais possédera de nombreux antigènes, qui pourra induire une réponse immunitaire), ou alors souches qui naturellement sont devenues moins virulentes, sélectionner des virus qui sont thermosensibles (grippe) cad le virus ne va pas bien se répliquer à la T° du corps humain et donc ne va pas être pathogène. On peut aussi produire des virus dans lesquels on va entraîner des lésions génomiques. Commercialisés : rougeole, fièvre jaune, rotavirus. Vaccins qui ont très bonne protection car ils provoquent production d’antigènes pendant un long moment et donc provoquer la production de cellules mémoire. Ces vaccins fonctionnent sur du long terme. Ils agissent aussi sur immunité humorale et immunitaire. Risque de réversion car une souche peu devenir virulente par mutation.

Question 32

- les vaccins inactivés ou tués

Answer 32

on prend le MO et on le tue. Un peu moins puissant que les précédents bien que réponse humoral et cellulaire très bonne (hépatite A). Ils ne nécessitent pas de rupture de chaîne du froid car peuvent être conservés à T° ambiante.

Question 33

- Le vaccins à sous unités recombinantes

Answer 33

faire produire par un MO un antigène spécifique qui va provoquer une réaction immunitaire. Insérer dans un plasmide le gène codant pour la protéine aux propriétés antigéniques (levures, bactéries, cellule euk). Ex : le virus hépatite B. Moins puissants que les 2 autres car le MO n’est pas en entier mais simplement 1 ou quelques antigènes. Exemple : gardasil, on a cloné dans une levure (Saccharomyces) les gènes codant la protéine du papillomavirus et la levure produit des particules lipidiques qui portent l’antigène à la surface ⇒ servent de vaccins.

Question 34

- Les vaccins vivants recombinants

Answer 34

prendre un MO atténué qui induit une réaction immunitaire, dans lequel on va cloner à l’intérieur du virus via un plasmide (et mieux si c’est sur chromosome) un gène codant pour un antigène d’un autre MO ou pour une cytokine permettant d’améliorer la réponse immunitaire. L’antigène va alors s’exprimer à la surface du virus de la vaccine. On a un MO qui induit une réaction immunitaire assez complète et qui va exprimer à sa surface les antigènes du MO pour lesquels on veut développer un vaccin. Candidats : vaccine, adénovirus, herpès. Inconvénient : 80% de la population infectée par le virus de l’herpès donc il peut y avoir une recombinaison entre le virus du vaccin et celui déjà présent chez les gens infectés.

Question 35

La vaccination

Answer 35

correspond à l’exposition volontaire à un germe à pathogénicité réduite et à immunogénicité conservée. Un bon vaccin, c’est un pathogène qui a perdu sa pathogénicité ou qui l’a réduite au maximum, mais qui a conservé son immunogénicité.

Question 36

La phagothérapie

Answer 36

Lorsqu’un phage infecte une bactérie, il s’adsorbe sur un site spécifique de cette dernière et ne va pas infecter toutes les souches, seulement celles pour lesquelles il y a des récepteurs pour s’adsorber. C’est ce phénomène qui déclenche l’injection du matériel génétique du phage dans la bactérie. Les phages à Adn sont les + courants. L’injection : queue contractile qui injecte ADN.

Question 37

phage virulent

Answer 37

quand ADN linéaire arrive dans bactérie il se recircularise et ruban d’ADN sectionné en différents morceaux qui vont se circulariser et une fois ADN circularisé il est transcrit et traduit → production des protéines qui composent queue et tête du phage. Emballage de l’ADN dans la capside (tête du phage) et les phages produites une enzyme qui permet la lyse de la bactérie (endolysine).

Question 38

phage tempéré

Answer 38

donne un cycle virulent. Mais quelque fois, l’ADN ne va pas se répliquer mais s’insérer dans le génome → quelque fois un répresseur bloque les gènes de virulence. Insertion se fait grâce à une enzyme = intégrase et l’insertion se fait au niveau des sites spécifiques ADN codant l’ARN de transfert chez la bactérie. L’ADN se transfère et reste sur le génome bactérien (état de prophage). Beaucoup de bactéries ont des prophages, ils font partie du MG de la bactérie et peuvent apporter des gènes (toxines qui provoquent TIAC). Dans certains cas il peut être induit si stress important qui abime l’ADN de la bactérie. Lorsque ce dernier est très abimé, il y a plein de lésions → bactérie met en place système SOS. C’est un opéron qui est composé de plusieurs gènes. Cet opéron est bloqué par un répresseur. Ce répresseur, lorsque le système SOS doit se mettre en route, est clivé par enzyme (Rec-A). Ainsi le répresseur n’est plus fixé sur promoteur donc gène s’exprime. Le répresseur qui réprime les gènes de virulence du phage lui aussi est clivé (effet secondaire) → les gènes de virulence ne vont plus être réprimés et donc vont s’exprimer ⇒ excision du chromosome bactérien d’ADN du phage et le phage va se répliquer ⇒ induction du prophage.

Question 39

quantité de bactériophages

Answer 39

Il faut utiliser phages en quantité (milliard de bactériophages / mL de solution). On peut consommer un produit tant que pas plus de 100 bactéries /g en fin de DLC ⇒ allonger la durée de vie d’un aliment.

Question 40

Méthode de criblage

Answer 40

échantillon sol, extraction ADN et PCR et amorces aléatoires → amplifier des fragments au hasard et clonage de ces fragments dans streptomyces ⇒ banque (isolat des bactéries qui possèdent plasmique avec un petit bout de cet ADN) que l’on va tester sur des cultures cellulaires ⇒ trouver des molécules actives.

Question 41

Vitamine B12 et MO

Answer 41

Produites par ≠ types de MO en fermenteur (bactéries propioniques) + Pseudomonas plus facile à cultiver que les bactéries propioniques. On doit rajouter du cobalt au fur et à mesure de la fermentation car si tout mis dès le début cela inhibe la croissance bactérienne.

Question 42

Enzymes et MO

Answer 42

beaucoup d’enzymes sont produites par MGM ou souches naturelles souvent pour transformer la MP de façon à ce qu’elle soit + facilement maniable, MP technologique. Cahier des charges bien précis pour ces enzymes.

Question 43

La biolixiviation

Answer 43

= méthode qui permet par des mécanismes d’oxydoréduction de solubiliser certains métaux qui sont présents dans du minerais contenant du fer et du soufre. Ces phénomènes permettent de solubiliser des métaux → récupérer l’eau dans laquelle se sont solubilisés et els métaux et les refaire précipiter pour les extraire. Permet d’extraire des métaux à partir d’un minerai très pauvre. Utilisé par des MO chimiolithoautotrophes cad source d’énergie = phénomènes d’oxydation chimique des minéraux. Procédé qui est très ancien.

Question 44

mutagenèse aléatoire

Answer 44

Mutagénèse aléatoire : rendre R aux phages, augmenter les rendements. Cultiver la souche et faire agir sur la souche un agent mutagène (UV, rayons X, agents chimiques) qui va provoquer des lésions sur ADN et si lésions trop importantes, les réparations génèrent des erreurs qui donnent lieu à des mutations. Plus il y a de liaisons plus les systèmes sont débordés. Faire agir un agent mutagène en dose assez importante = tuer la moitié de la population bactérienne → nécessite des expériences préliminaires (UV ça joue sur le temps d’action). Isoler les MO résultants sur un milieu de culture (dénombrement). Recouvrir la boite de Pétri avec des bactériophages et vont se développer que les mutants résistants. Intérêts de la mutagénèse : - pas besoin de connaissances sur la génétique du MO. Lorsqu’on fait du génie génétique il faut des outils (vecteurs de clonage) et ces outils sont très longs à mettre en place. Avec mutagénèse aléatoire, plus de souci. - Utiliser ces mutants dans les fermentations alimentaires (pain, fromages, vin) car pas considérés comme OGM car on ne fait que mimer des phénomènes « naturels » dans le monde vivant.