Module 4- La structure primaire des protéines Flashcards

Question

Quesque les analyzes de comparaison de l'ADN in silico (par ordinateur) ne peuvent prédire sur les protéines?

Answer 1

les modifications post-traductionnelles et si la protéines est composée d'une ou de plusieurs sous-unités

Answer 2

Qu'ils ont probablement des séquences similaires

Answer 3

``` homologue= degrés significatif de similarité de séquence (dérivé d'un ancêtre commun, peuvent être orthologue ou paralogue) orthologue = deux protéines homologues ayant la même fonction de deux organismes différents paralogue = protéines homologues dans un même organisme et ayant des rôles différents ```

Answer 4

Lorsqu'un résidu montre une grande variabilité entre les espèce, il n'a pas une grande importance et le contraire est vrai. La substitution conservatrice est lorsqu'un résidu est substitué par un autre aux caractéristiques semblables

Answer 5

C'est un schéma réaliser selon le pourcentage de similarité entre protéines orthologues de plusieurs espèces. Ils permettent d'illustrer la distance évolutive entre les organismes.

Answer 6

On doit d'abors préparer l'extrait de protéine 1. libération du contenu cellulaire : On brise alors les membarnes pour libérer le contenu untracellulaire. 2. Centrifugation différentielle : on fait des centrifugation à différentes vitesses et temps pour éliminer les particules non désirées tels que les résidus de membranes et oorganites

Answer 7

La charge et la polarité qui eux dépendent du pH et de la force ionique

Answer 8

La protéine est à sa solubilité minimal lorsque son pI=pH ainsi sous sa forme zwitterion. Ainsi lorsque le pI = pH on peut rendre la protéine insoluble et la faire précipité.

Answer 9

Lorsque la concentration en sels est faible, on parle de salting in, là où les ions favorisent la solubilité de la protéine (faible force ionique). Salting out est lors d'une concentration de sels élevées où les ions accaparent l'eau et diminuent la solubilité de la protéine (forte force ionique)

Answer 10

On peut atteindre la solubilité minimale si le pH=pI et lors d'une forte présence de sels. On peut cibler la protéine voulu et la faire précipité ou la rendre surnageante. On centrifuge ensuite l'échantillon pour séparer la protéine voulue. Lorsque la protéine cible est le précipité, cette étape sert aussi à concentrer la protéine. On se débarasse alors délicatement du surnageant et de solubiliser la protéine dans un plus petit volume de tampon. Mais cette méthode demande de réduire ensuite la concentration en sels qui peut nuire aux prochaines étapes (par dialyse ou chromatographie d'exclusion)

Answer 11

Phase stationnaire (bas colone): susbtance insoluble contenue dans la colone et interagissant avec la protéine et varie selon la propriété utilisée pour la purification. Phase mobile(haut colone): échantillon contenant la protéine cible

Answer 12

Après avoir placé la phase stationnaire puis mobile, on ajoute continuellement du solvant pour entrainer les différents composé de l'échantillon vers le base de la colonne. Les différentes protéines seront entraînées à des vitesses variables. Plus une protéine interagira avec la phase stationnaire plus ce serra long avant dillution. On récupère au bas de la colonne selon une séquence et chaque tubes serra analysés par spectroscopie pour détecter celles contenant ces molécules.

Answer 13

Elle purifie selon la taille Elle est comme la chromatographie de base mais la phase stationnaire est constitué de bille (ayant des grosseurs de pores contrôlés) ralentissant les protéines selon leur taille. MAIS ATTENTION, LES GROSSES MOLÉCULES MIGRENT LE PLUS VITE car elles ne peuvent entrer entre les pores des molécules et migrent alors rapidement.

Answer 14

On peut estimer sa masse moléculaire par comparaison avec des masses moléculaires connues de protéines qu'on y rajoutent. (MAIS QU'UNE APPROXIMATION)

Answer 15

La phase stationnaire est est composées de billes inertes et insolubles sur lesquels sont fixés des groupements anionique (résine chargée + liant les anions) ou cationique (résine chargée - liant les cations). On envoit notre échantillon qui serra suivit d'un solvant salin où les Na+ entreront en compétition et feront décrocher de manière graduelle les protéines en commençant par ceux ayant de moins forts liens.

Answer 16

Ici, la phase stationnaire est composé de polymères lié de façon covalente à un ligant ciblant une protéine X (ex: coenzyme, susbtrat, anticorps, etc) Lorsqu’un mélange de protéines circule à travers la colonne, seule celle qui a une affinité importante pour le ligand est retenue. Les autres protéines migrent avec le flux de solvant. On peut par la suite éluer la protéine cible de deux façons : en changeant le pH du flux de solvant, ce qui brise les interactions faibles entre le ligand et la protéine, ou en ajoutant une solution contenant une forte concentration de ligand. Les liaisons faibles qui retiennent le ligand à la protéine se brisent et se reforment constamment. Lorsque la concentration du ligand libre est beaucoup plus élevée que celle du ligand fixé à la résine, les protéines ont plus de chances de reformer les liaisons avec les molécules de ligand libre, ce qui les libère de la colonne. Elles seront donc récupérées avec le flux de la solution de ligand libre.

Answer 17

la chromatographie liquide à haute performance, communément appelée HPLC. C’est en quelque sorte une version robotisée de la chromatographie. Le flux de solvant est contrôlé par un ordinateur et la colonne est pressurisée. De plus, la colonne est habituellement reliée à un détecteur, par exemple un spectrophotomètre, et à un collecteur de fractions. Un appareil de HPLC peut servir à presque tous les types de chromatographie sur colonne, il suffit d’utiliser une colonne qui contient la résine appropriée

Answer 18

Détection et dosage vérification de la pureté détermination de la masse moléculaire détermination du pI

Answer 19

Ces acides aminés absorbent les UV. Alors on utilise la spectrophotométrie. (La tyrosine et le tryptophane ont un maximum d'absorption de la lumière à une longueur d'onde d'environ 280 nm, tandis que la phénylalanine a une absorption maximale à une longueur d'onde 260 nm. )

Answer 20

l’absorbance d’une solution contenant un soluté X est directement proportionnelle à sa concentration.

Answer 21

Dans le cas de mélanges de protéines ou d’une protéine dont le coefficient d’extinction molaire n’est pas connu, il faut avoir recours à des méthodes colorimétriques. Ainsi, les protéines seront traitées avec des réactifs de manière à ce qu’elles absorbent la lumière visible. Plusieurs méthodes de dosage de protéines sont basées sur la coloration. Pour déterminer la concentration dans les échantillons colorés, une courbe standard ou courbe étalon devra être construite. (densité optique en fonction de la concentration)

Answer 22

On regroupe sous le terme électrophorèse les méthodes permettant de séparer les composantes d'un mélange en fonction de leur vitesse de migration dans un gel en présence d'un champ électrique. Lors de l'électrophorèse, les molécules chargées migrent vers l'électrode de charge opposée. Trois facteurs influencent la migration d'une molécule dans un gel : sa charge, bien sûr, mais également sa forme et sa masse moléculaire. Les molécules doivent passer au travers du réseau de pores présent dans le gel. Contrairement à la chromatographie d'exclusion, les plus grosses molécules ne sont pas exclues. Par conséquent, pour une même charge, les petites molécules migrent plus rapidement que celles de grande taille, car elles se faufilent plus facilement dans le réseau du gel. Les grosses molécules rencontrent plus de résistance. Une fois la migration terminée, le gel est traité avec un colorant afin de visualiser les différentes composantes.

Answer 23

PAGE =électrophorèse sur gel d'acrylamide en conditions natives SDS-PAGE = même chose mais en conditions dénaturantes IEF (IsoElectric Focusing) = focalisation isoélectrique OUI

Answer 24

pour vérifier la pureté d’une solution protéique

Answer 25

Le PAGE en absence de SDS ne permet pas de déterminer la masse moléculaire ou le pI d’une protéine. Le SDS-PAGE et la focalisation isoélectrique ont été développés afin de permettre ce type d’analyses.

Answer 26

c'est l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes. Les échantillons protéiques sont préalablement traités avec du SDS et un agent réducteur afin de dénaturer la protéine, c’est-à-dire afin de détruire sa structure tridimensionnelle (sa forme). Le SDS, qui est un détergent, permet le bris des interactions non covalentes, tandis que l’agent réducteur, souvent le β-mercaptoéthanol, détruit les ponts disulfures. Le tampon utilisé pour préparer le gel contient également du SDS; la présence de ce détergent permet de s’assurer que les protéines demeureront dénaturées durant l’électrophorèse. Le SDS a une seconde fonction dans ce type d’électrophorèse. Les molécules de SDS sont chargées négativement. Le nombre de molécules de SDS qui se lient à une protéine est proportionnel à la taille de celle-ci. Par conséquent, les protéines mises en présence de SDS ont une densité de charge négative uniforme. La méthode SDS-PAGE permet donc de séparer les protéines selon leur masse moléculaire uniquement.

Answer 27

Lors d’un SDS-PAGE, il faut déposer dans un premier puits un mélange de protéines de masses moléculaires connues, appelées marqueurs. L’échantillon contenant la protéine de taille inconnue est ensuite déposé dans le second puits. Après migration, le gel est coloré. Puis, les distances parcourues par la protéine inconnue et les marqueurs de masse moléculaire sont mesurées. Une courbe standard exprimant le log de la masse moléculaire en fonction de la distance nous permet ensuite d’estimer la masse moléculaire de la protéine inconnue.

Answer 28

En plus de nous renseigner sur la pureté et la masse moléculaire d’une protéine, le SDS-PAGE peut nous donner des indices sur sa structure 3D. En effet, on peut détecter la présence de ponts disulfures en comparant des échantillons de la protéine avant et après traitement avec un agent réducteur. On peut également déterminer le nombre de chaînes polypeptidiques formant la protéine en comparant les masses moléculaires estimées par chromatographie d’exclusion avec celles obtenues sur SDS-PAGE avec des échantillons traités et non-traités au b-mercaptoéthanol.

Answer 29

Le pI d'un peptide ou d'une protéine.Le gel de polyacrylamide utilisé pour ce type d’électrophorèse contient un gradient de pH; c'est-à- dire qu’une extrémité du gel est basique, tandis que l’autre est acide. Le pH diminue graduellement le long du gel. À pH très basique, les protéines portent toutes des charges nettes négatives; elles migrent donc vers l’électrode positive. À mesure qu’elles migrent dans le gel, il y a modification de leur charge nette, car le pH du gel change. Lorsqu’une protéine se situe dans la zone du gel correspondant à son point isoélectrique, elle ne porte plus de charge nette. Par conséquent, elle n’est plus entraînée par le champ électrique et il y a arrêt de sa migration.

Answer 30

Il s’agit de faire une première migration dans un gel contenant un gradient de pH, ce qui permet de séparer les protéines selon leur pI. Ce gel est ensuite placé horizontalement sur le dessus d’un gel de type SDS-PAGE. Au cours de cette seconde migration, les protéines sont séparées selon leur masse moléculaire.

Answer 31

La protéomique est l’étude du protéome, c’est-à-dire de l’ensemble des protéines d’un organisme.

Answer 32

La spectrométrie de masse est utilisée pour déterminer la masse moléculaire et la structure primaire des peptides. Dans ce type d’analyse, on mesure le temps que prend une molécule chargée en phase gazeuse pour voyager dans un tube. D’abord, il faut savoir que les peptides ne peuvent pas être vaporisés par chauffage, car la chaleur les détruit. Deux techniques permettent d’amener les peptides en phase gazeuse : l’ionisation par électrodispersion, plus connue sous le terme ESI, et de la désorption au laser favorisée par la matrice, appelée aussi MALDI. L’ESI utilise un voltage élevé afin de vaporiser les peptides. Pour le MALDI, les peptides sont associés à une matrice qui est excitée par un laser. L’excitation de la matrice entraîne la vaporisation des peptides. Une fois les peptides vaporisés, ils doivent passer dans un champ électrique, puis traverser un tube, avant d’atteindre le détecteur. Le temps que prend un peptide pour parcourir ce tube, ce qu’on appelle le temps de vol, dépend du rapport de sa masse sur sa charge (noté m/z). Les masses moléculaires des peptides sont déterminées à l’aide de logiciels de bio-informatique spécialisés LA MÉTHODE LA PLUS PRÉCISE!!! 1 pmol peut suffire!!

Answer 33

La méthode de spectrométrie de masse

Answer 34

la chromatographie d'exclusion, le SDS-PAGE et la spectroscopie de masse

Answer 35

La 1re étape consiste à briser les ponts disulfures entre les résidus cystéine à l’aide d’un agent réducteur tel que le β-mercaptoéthanol. Cependant, rien n’empêche les ponts disulfures de se reformer par la suite. Il faut donc également traiter la protéine avec un agent d’alkylation, tel que l’iodoacétate, qui bloque les groupements –SH

Answer 36

la chaleur, un détergent (SDS), ou un agent chaotropique (urée)

Answer 37

Par HPLC ou électrophorèse

Answer 38

peptidique, extrêmes,acide,très élevée

Answer 39

On utilise le réactif d’Edman, soit le phénylisothiocyanate ou PITC, pour traiter les produits de l’hydrolyse. En milieu basique, le PITC se lie au groupement α-amine de chaque acide aminé. Les acides aminés ainsi marqués sont appelés PTC-acides aminés. Les PTC-acides aminés portent un cycle aromatique, ce qui les rend détectables par spectrophotométrie UV (254 nm).

Answer 40

On est a l'étape d'analyse qui serra fait par HPLC. Le temps que prend un PTC-acide aminé donné pour être élué est comparé avec les temps d’élution des 20 acides aminés standards marqués au PITC. Certains acides aminés sont partiellement détruits dans les conditions extrêmes de l’hydrolyse acide. C’est le cas des acides aminés asparagine et glutamine pour lesquels l’hydrolyse détruit les groupements amides. Il est donc impossible de distinguer un aspartate d’une asparagine et un glutamate d’une glutamine. On utilise des codes à 1 et 3 lettres particuliers pour indiquer cette ambiguïté. Il faut noter que l’échantillon utilisé lors de cette étape ne peut plus servir pour les étapes subséquentes.

Answer 41

L’analyse de l’extrémité N-terminale utilise également le PITC. On marque tout d’abord les chaînes obtenues à l’étape 2. Comme une chaîne polypeptidique n’a qu’une seule fonction α-amine libre, il y aura ajout d’une seule molécule de PITC. On traite ensuite le PTC-peptide avec de l’acide trifluoroacétique, ce qui libère le résidu en N-terminale. Finalement, le PTC-acide aminé relargué est analysé par HPLC comme à l’étape 3 Pour ce qui est de l’extrémité C-terminale, on libère le résidu à cette extrémité en utilisant une carboxypeptidase. Une fois libéré, ce résidu est traité avec le réactif d’Edman. Ensuite, il est identifié par HPLC. Encore une fois, il faut noter que l’échantillon utilisé lors de cette étape ne peut plus servir pour les étapes subséquentes

Answer 42

On doit par la suite couper chacune des chaînes polypeptidiques obtenues à l’étape 2 afin d’obtenir une série de fragments contenant entre 30 et 40 résidus. Pour ce faire, on utilise des méthodes enzymatiques ou chimiques. Les endopeptidases coupent les liens peptidiques à l’intérieur de la chaîne. La trypsine et la chymotrypsine en sont deux exemples. Chacune reconnaît des acides aminés spécifiques et coupe le lien peptidique avec le résidu suivant si celui-ci n’est pas une proline. En effet, les protéases sont souvent sensibles à la présence d'une proline. Cela est dû à la structure particulière du groupement amine de la proline. Je vous rappelle que la proline est le seul acide aminé standard à avoir un groupement amine secondaire. Les méthodes chimiques ont des modes d’action plus variés. \* voir tableau pour plus de précision

Answer 43

Dégradation d'Edman (on doit séparer les fragments avant l'analyse) Spectroscopie de masse (ne necessite pas de séparation et de plus en plus utilisée)

Answer 44

La dégradation d’Edman est en fait une succession d’analyses du résidu en N-terminal. À la fin de chaque analyse, on récupère le peptide raccourci d’un résidu et on l’utilise pour une nouvelle réaction au PITC. Comme il y a perte de molécules lors de la récupération du peptide n-1, cette méthode est moins efficace avec les longs peptides. La taille moyenne des peptides analysés par cette méthode est de 30 à 40 résidus.

Answer 45

Pour reconstruire la séquence complète, les séquences de 2 séries distinctes de fragments sont nécessaires. C’est pourquoi les étapes 5 et 6 doivent être répétées avec une deuxième méthode de fragmentation. Les chevauchements entre les 2 séries de fragments permettent de déterminer l’ordre des fragments dans la séquence primaire finale

Answer 46

En résumé, lorsqu’on séquence une protéine par la méthode de dégradation d’Edman, on doit commencer par briser les ponts disulfures et les interactions non covalentes qui lui confèrent sa structure tridimensionnelle. Les différentes chaînes formant la protéine sont ensuite séparées. On utilise une partie de chacun de ces échantillons pour déterminer la composition de chaque chaîne. La nature des résidus aux extrémités est ensuite analysée en utilisant une autre partie des échantillons. Finalement, chaque chaîne est clivée en courts fragments dont les séquences sont ensuite déterminées par la méthode de dégradation d’Edman. Il faut obtenir les séquences d’au moins 2 séries de fragments différents afin de pouvoir reconstruire la séquence complète de chaque chaîne.

Answer 47

En résumé, lorsqu’on séquence une protéine par la méthode de dégradation d’Edman, on doit commencer par briser les ponts disulfures et les interactions non covalentes qui lui confèrent sa structure tridimensionnelle. Les différentes chaînes formant la protéine sont ensuite séparées. On utilise une partie de chacun de ces échantillons pour déterminer la composition de chaque chaîne. La nature des résidus aux extrémités est ensuite analysée en utilisant une autre partie des échantillons. Finalement, chaque chaîne est clivée en courts fragments dont les séquences sont ensuite déterminées par la méthode de dégradation d’Edman. Il faut obtenir les séquences d’au moins 2 séries de fragments différents afin de pouvoir reconstruire la séquence complète de chaque chaîne.

Answer 48

Il s’agit de 2 spectromètres de masse séparés par une cellule de collision. Les fragments peptidiques sont vaporisés par ESI ou par MALDI; ils passent ensuite dans un premier spectromètre qui nous donne leur ratio masse/charge. Un par un, les fragments sont dirigés vers une cellule de collision où des molécules de gaz inerte viennent les fragmenter en plus petites molécules. Tous ces produits passent dans un 2 ieme spectromètre où leurs masses sont déterminées.

Answer 49

Par comparaison des masses obtenues avec les masses théoriquement possibles pour les protéines disponibles dans les bases de données, on peut déterminer les séquences des fragments peptidiques et identifier la protéine correspondante. En français, on appelle cette technique de comparaison « empreinte de masse peptidique », mais l’emploi du terme « peptide mass fingerprinting » est fréquent. Cette technique a remplacé la dégradation d’Edman comme méthode principale de détermination de la structure primaire des protéines. C’est une méthode de choix, car la spectrométrie de masse est très sensible et nécessite moins d’étapes. Lorsqu'on utilise la spectrométrie de masse et l'empreinte de masse peptidique pour obtenir la séquence d'une protéine, les chaînes polypeptidiques ainsi que les fragments n'ont pas besoin d'être séparés avant l'analyse. De plus, l'analyse d'une seule série de fragments est généralement suffisante. Finalement, il est inutile de déterminer la composition des chaînes polypeptidiques ainsi que la nature de leurs extrémités pour obtenir une séquence complète avec cette méthode.

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