Nachweismethoden Flashcards

Question

Wie bestimmt man die Protein-Raumstruktur (3D) [Tertiärstruktur] ?

Answer 1

Röntgenstrukturanalyse * Gerätschaft: Entsprechendes Röntgengerät * Prinzip: * 1.Kristalliasation des Proteins [Umsetzung: Das schrittweise Hinzugeben von Salzen zu einer Lösung verringert die Löslichkeit eines Protein, sodass sich ein hochgeordneter Proteinkristall bildet] * 2.Proteinkristall den Röntgenstrahlen aussetzen: Ein Großteil der Strahlen geht unbeeinflusst durch den Kristall durch, ein Teil wird aber von den Elektronen im Kristall gebeugt * 3.Durch das unterschiedliche Ausmaß an Beugung, Verstärkung und Interferenz entsteht ein charakteristisches Muster * 4.Charakteristisches Muster lässt Rückschlüsse auf die Elektronenverteilung und damit auf die räumliche Struktur des Proteins zu

Answer 2

* Zur Aufklärung von Modifikationen wie * Glykosylierung * Phosphorylierung• * Hydroxylierung * Methylierung * Acetylierung * Carboxylierung ... sind spezifische Analyseverfahren notwendig

Answer 3

Anfärbung, Bio-Assays, Immundetektion (RIA, ELISA, WESTERNBLOT)

Answer 4

* Im Vergleich zu den anderen unter „Nachweis“ fallenden Methoden, ist die Anfärbung sehr ungenau, da unspezifisch * Erfolgen kann die Anfärbung mit Coomassie-, Silber- oder Ponceau-S-Färbung * Beispiele: * 1.Enzym-Untersuchung: Colorimetrischer Amylase Test: * Bei dem colorimetrischen Amylase-Test kann die Aktivität und Konzentration von Amylase – einem Enzym – untersucht werden * Prinzip: * Stärke reagiert mit Jod zu einem blauen Farbkomplex * Amylase baut Stärke ab –der blaue Farbkomplex wird bei Anwesenheit von Amylase also weniger stark oder gar nicht ausgebildet

Answer 5

* Testverfahren zur Analyse der Wirkung einer bekannten oder unbekannten aktiven Substanz auf lebendes Gewebe. Mit Hilfe von Bio-Assays kann z.B. die Anwesenheit von Enzymen oder Hormonen in einer Probe nachgewiesen werden. * Die untersuchten Proteine müssen also biologisch aktiv sein, damit beschränkt sich dieser Nachweis auf die Hormon-/Enzym-Untersuchung * Bei Enzymen erfolgt der Funktionstest durch Nachweis ihrer katalytischen [Enzyme sind Katalysatoren] Eigenschaften: Sind sie vorhanden und arbeiten korrekt, muss dies im Test entsprechend nachweisbar sein * Die so beobachtete bioglische Aktivität erlaubt Aussage über Funktion + Menge * Messprinzip: Colorimetrisch (Farbstoffentwicklung) oder spektroskopisches Messprinzip * Beispiele: * 1.Hormon-Untersuchung: Funktionstest am Beispiel Insulin * Eine Probe wird einem Versuchstier gespritzt; anschließend wird dem Tier Blut abgenommen * Ist Insulin in der Probe enthalten, wird die Untersuchung der Blutprobe dies anhand des Blutzuckerspiegels anzeigen. Damit können Rückschlüsse auf die Menge und Aktivität des Insulins in der untersuchten Probe gezogen werden. * 2.Krallenfrosch-Schwangerschaftstest

Answer 6

* Mithilfe immunologischer Nachweisverfahren können Proteine in komplexen Proben oder auch in Gewebeschnitten durch Verwendung hoch spezifischer Antikörper nachgewiesen werden. Die Basis für solche Nachweismethoden ist die Herstellung von Antikörpern gegen ein bestimmtes Antigen (hier ein Protein). Wir betrachten: ELISA, RIA und Westernblot * Prinzip: Folglich ist das zugrundeliegende Prinzip aller Immundetektorischer Verfahren die Reaktion eines bestimmten hochselektiven Antikörpers (AK) mit einem bekannten Antigen (AG) * Exkurs: Antikörper werden in 5 Klassen eingeteilt: IgG, IgE, IgA, IgM, IgD [Ig steht jeweils für „Immunoglobulin“]. * Antikörpergewinnung: * Da wir für die Immundetektion Antikörper benötigen, hat die Vorlesung einen Blick auf die Gewinnung von Antikörpern geworfen. Unterschieden werden kann hier zwischen „pAK“: Polyklonale Antikörper und „mAK“: Monoklonale Antikörper * Generierung polyklonaler Antikörper: * Ablauf: * 1.Immunisierung (= Spritzen des Antigens, z. B. ein virales Protein) des Tieres, welches zur Antikörpergewinnung genutzt wird * 2.Gewinnung des Serums; Titerbestimmung (Affinität Antikörper-Antigen); Konservierung und Konfektionierung * Generierung monoklonaler Antikörper * Ablauf: * 1.Produktion von Immunglobulinen der selben Art [Kein Gemisch wie bei pAK] * 2.Die angelegte Zellkultur ist unsterblich und produziert ewig

Answer 7

* Aufbau und Ablauf: * Mikrotiterplatte mit kleinen, napfförmigen Vertiefungen („Näpfen“), in denen der Antikörper wohnt [Er ist „immobilisiert“], den wir nutzen wollen, um unsere Probe zu untersuchen * Pipettierung des Probengemisches, das (hoffentlich) das gesuchte Antigen („Analyt“) enthält, in die napfförmigen 24Vertifungen * Der Antikörper fischt sich sein Antigen und bindet diesen * Abwaschen der nichtgebundenen Proteine-Zugabe eines enzymgebundenen Antikörpers [Der logischerweise ebenfalls spezfisch für unser gesuchtes Protein (= Antigen) sein muss] [Die Zugabe eines weiteren Antikörpers, der ebenfalls an unser Protein bindet, erklärt auch den Namen „Sandwich-ELISA“: Das gesuchte Protein (= Antigen) ist zwischen den beiden Antikörpern eingeschlossen] * Es wird ein passendes Substrat hinzugegeben, das vom Enzym umgesetzt werden kann und zu einer Farbreaktion führt, die mit einem Photometer gemessen werden kann * Bsp. für ELISA aus dem Alltag: Der Schwangerschaftstest (Schnelltest) * Der Schnelltest ist ein immunchromatographischer Test * Bei einer Schwangerschaft befindet sich ab dem 10. Tag das Hormon hCG im Urin * Schwangerschafts-Farbstreifen: Auf dem Teststreifen des Schwangerschaftstest befindet sich ein immobilisierter Antikörper, an den hCG bindet. Anschließend bindet ein Enzym-Linked-Antikörper an hCG (-\> Entstehung des Sandwiches, s. o): Es kommt zu einer Färbung-Kontrollstreifen: Wurde der Test korrekt (mit ausreichender Urinmenge) durchgeführt, sollte sich ein Kontrollstreifen bilden. Da dafür ebenfalls der Antikörper genutzt wird, der auch an hCG [Der Enzym-Linked-Antikörper] bindet, für den Kontrollstreifen aber eine weitere Strecke zurücklegen muss, stellt dies sicher, dass genügend Urin auf den Teststreifen aufgetragen wurde. Der Antikörper bindet an einen weiteren immobilisierten Antikörper, sodass auch hier eine Farbreaktion hervorgerufen wird.

Answer 8

* Prinzip: Ähnlich dem ELISA, nur dass anstelle des enzymatischen Nachweises ein radioaktiver Nachweis verwendet wird. Ist dabei sehr empfindlich (Supi! Kann also auch kleinste Mengen nachweisen!), aber eben leider auch radioaktiv (Nicht so supi!). * Wir haben wieder Antikörper-Und Antigene, die wir radioaktiv markieren [„Kontroll-Antigene“]. Die Antigene docken an die Antikörper * Wir geben eine Probe hinzu, in dem ebenfalls Antigene [Antigene, die wir untersuchen wollen] enthalten sind, die auch an den Antikörper binden können. * Es kommt zu einer kompetitiven Reaktion: Die durch unsere Probe neu hinzugekommenden Antigene [Antigene, die wir untersuchen wollen] konkurrieren mit den radioaktiv markierten Antigenen [„Kontroll-Antigene“] um die Bindungsplätze an den Antikörpern. Durch diesen Wettbewerb verlieren einige der radioaktiven Antikörper ihren Bindungsplatz und werden frei: Diese frei gewordene Menge ist proportional zu den hinzugegebenen Anitgenen unserer Probe, sodass wir auf die Menge der Antigene in unserer Probe rückschließen können

Answer 9

* Methode zur Protein-Qualitätsbestimmung (Größe (-\> SDS-PAGE) + immunologische Eigenschaft (-\> Antikörperbindung)) * Zuerst: SDS-PAGE [s. o.] zur Trennung der Proteine * Anschließend: Übertragung der Proteine aus dem SDS-Gel auf eine dünne Membran [Grund: Solange sie sich im Gel befinden, sind sie unzugänglich für die großen Antikörpermoleküle, die wir für unsere Analyse benutzen] * Technik der Übertragung: Platzierung des SDS-Gels auf der Membran; Anlegung einer Spannung senkrecht zur Gelebene [Elektrophorese]: Die negativ geladenen Proteine wandern zur Anode, d.h. zur positiv geladenen Elektrode. Zwischen Gel und Anode liegt die Membran. Ergebnis: Die im Gel nach ihrer Größe aufgetrennten Proteine befinden sich auf der Membran, wobei das in der Elektrophorese erzeugte Bandenmuster erhalten bleibt. * Zugabe des primären Antikörpers: Er bindet an die Proteine, die das von ihm erkannte Antigen enthalten * Zugabe des sekundären Antikörpers: Dieser bindet an den primären Antikörper [Achtung, Achtung: Nicht wie bei ELISA an das Antigen!]. Der sekundäre Antikörper ist i. d. R. an ein Enzym gekoppelt oder selbst fluoreszenzmarkiert

Answer 10

Lokalisierung von Proteinen mittels markierter Antikörper in histologischen Schnitten: Methode zur zellulären Markierung von Proteinen: „Antikörper ermöglichen es, Proteine, Polysaccharide u.ä. hochspezifisch nachzuweisen und damit Zellen genauer zu identifizieren. Die eingesetzten Antikörper erkennen diese Strukturen und machen somit Differenzierungsmarker, therapeutische Zielproteine, Erregerproteine oder Funktionsproteine sichtbar.“

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