oczyszczanie białek

Question 1

chromatografia powinowactwa elucja

Answer 1

wspołzawodnictwo o miejce wiązania, niskie lub wyskoie pH, wysoka siła jonowa, denaturanty

Question 2

chromatografia powinowactw zalety

Answer 2

Szybkość: możliwość uzyskania czystego preparatu w jednym kroku

Możliwość zagęszczenia próbki

Brak ograniczeń co do objętości próbki

Wysoka specyficzność

Wysoki stopień czystości

Question 3

chromatografia powinowactw wady

Answer 3

Konieczność samodzielnego przygotowania złoża w przypadku trudności z pozyskaniem odpowiedniego

Niestabilność niektórych ligandów, utrudniająca ich związanie do złoża

Question 4

złoże +

Answer 4

DEAE-celuloza

Question 5

złoże -

Answer 5

CM-celuloza

Question 6

pH powyżej pI

Answer 6

Znak -

Question 7

etykietka His-Tag

Answer 7

wiązanie z niklem (złoże IDA-agaroza)
nie zwiększa rozpuszczalności
beta-markaptoetanol żeby nie wiązało się s-s
bufor zawierajacy imidazol żeby nie było odd. niespecyficznych
elucja w gradiencei imidazolu
imidazol może zaburzyć badanie NMR lub krystalograficzne, wywoływać agregację białka (bufor neutralizujący)

Question 8

Strep-Tag:

Answer 8

zmodyfikowana genetycznie streptawidyna (oddziaływanie streptawidyna-biotyna)

Question 9

S-tag:

Answer 9

15-aminokwasowy fragment rybonukleazy A (elucja w drastycznych warunkach)
do badania aktywności enzymatycznej białka

Question 10

GST-Tag:

Answer 10

S-transferaza glutationowa; elucja na złożu z immobilizowanym glutationem; elucja w warunkach niedenaturujących; duże białko- musi zostać oddzielone od białka rekombinowanego (sekwencje rozpoznawane przez enzymy hydrolizujące)

Question 11

MBP-Tag:

Answer 11

białko rozpoznające mannozę

Question 12

Proteazy wykorzystywane do usuwania znaczników:

Answer 12

enterokinaza, trombina, czynnik Xa

Question 13

ogólne etapy oczyszczania z ciałek inkuzyjnych

Answer 13

1. izolacja (sonikacja)
2. rozpuszzcanie - czynniki denaturujące
3. renaturacja - oczyszcanie przed renaturqacją np. dializa, potem 3 podejścia
   a. związanie z podłozem i stopniowe usówanie denaturanta
   b. usunięcie denaturanta przez sączenie molekularne
   c. imobilizacja na złożu substanji ułatwiającej fałdowanie

Question 14

fałdowanie zależy od

Answer 14

zależy od:

Stężenia białka

Sekwencji aminokwasowej

Metody wykorzystanej do zmniejszania stężenia denaturanta

Składu buforu renaturującego