produkcja białka w E.coli

Question 1

wady w e.coli

Answer 1

brak modyfikacji potranslacyjnej
brak mostków siarczkowych
nie można białek błonowych
obecnośc PLS w produkcie'
brak wydajnego systemu sekrecji białek

Question 2

replikon

Answer 2

jego wybór determinuje liczbę kopii, pozwala utrzymać stałą liczbę kpii plazmidu w komórce, aby replikacja nie obziążała nadmiernie

Question 3

pETcoco

Answer 3

utrzymanie pojedynczej kopii plazmidu w komórce do momentu inducji arabinozą

Question 4

problemy przy produkcji białek w cytoplazmie

Answer 4

redukujące środowisko uniemożliwia powstawanie mostków
endogenne proteazy
agregacja białka w postaci białek inkluzyjnych

Question 5

rozwiązania: brak syntezy mistków

Answer 5

szczep origami

Question 6

rozwiązanie: proteazy

Answer 6

BL21

Question 7

replikony niskokopijne

Answer 7

żeby nie obiążać, ColE1 lub p15A

Question 8

rozwiązanie: ciałka inkluzyjne

Answer 8

zmiana warunków prowadzenia hodowli(niska temperatura, słabszy promotor, mniejsze stężeni induktora) przyłączeni znaczników, koekspresja białek opiekuńczych

Question 9

zaleta: ciałka inkluzyjne

Answer 9

ochrona przed proteazami, wygodny sposób wstepnego oczyszczania

Question 10

peryplazma

Answer 10

konieczność sekwencji N-końcowej, która jest odcinana po translokacji

Question 11

peryplazma zalety

Answer 11

• możliwość wprowadzenia mostków dwusiarczkowych (peryplazma
  jest środowiskiem utleniającym);
• ochrona białka przed działaniem cytoplazmatycznych proteaz;
• niższy stopień zanieczyszczenia preparatu innymi białkami →
  łatwiejsze oczyszczanie;
• ochrona komórki przed toksycznym działaniem syntetyzowanego
  białka;
• usunięcie N-końcowej metioniny przy okazji usuwania sekwencji
  sygnałowej.

Question 12

peryplazma wady

Answer 12

• transport białek do peryplazmy nie zawsze jest wydajny, tzw.
  „zapychanie błon”, rozwiązanie → ograniczenie nadekspresji białka;
• możliwość tworzenia ciał inkluzyjnych w przestrzeni
  peryplazmatycznej;
• powstawanie nieprawidłowych mostków dwusiarczkowych;
• ograniczona wielkość transportowanych białek;
• łatwe przedostawanie się białek z peryplazmy do pożywki.

Question 13

sekrecja na zwenątrz zalaty

Answer 13

najmniej zanieczyszczone

Question 14

sekrecja na zewnątrz wady

Answer 14

brak efektywnych systemów sekrecji

Question 15

sekrecja na zwenątrz rozwiązanie

Answer 15

szczepy nieposiadające błony (sekwencja sygnałowa do cytplazmy)
zwiększnie przepuszczalności błony,
białka budujące aparat sekrecji

Question 16

etapy hodowli do ekspesji

Answer 16

Przygotowanie wektora

Transformacja bakterii

Założenie „hodowli matki” z pojedynczej transformowanej kolonii, w niewielkiej objętości

Zaszczepienie „hodowlą matką” dużej objętości pożywki (1-2 l)

Prowadzenie hodowli do osiągnięcia odpowiedniej gęstości optycznej OD600=0,5-0,6
Indukcja (sposób indukcji zależny od promotora)

Monitorowanie wzrostu

Pobranie próbek do póżniejszego oznaczania

Zakończenie hodowli- wirowanie bakterii

Zamrożenie osadu (ewentualne)

Izolacja białka (sonikacja)

Oczyszczanie

Question 17

system pET

Answer 17

polimeraza RNA faga T7 pod promotorem lacUV5 indukowanym IPTG, białka rekobinowane pod promotorem dla polimerazy T7 indukowanym IPTG, małe plazmidy pLysS