Pag 13-18 Flashcards
(42 cards)
Definizione di unità enzimatica
quantità di enzima in grado di convertire 50 microM di substrato in 1 min a 25°
Definizione di attività specifica di un enzima
unità enzimatica rapportata ai mg di proteina
Definizione di saggio enzimatico
esperimento per misurare la comparsa di prodotto o la scomparsa di substrato in cui la concentrazione di enzima è irrilevante
Per cosa posso utilizzare un saggio in continuo?
Per monitorare il real time la concentrazione di substrato sfruttando:
- fluorescenza
- chemiluminescenza
- assorbanza
- ddp
- produzione di gas: monitoro la pressione
- generazione di uno stereoisomero: uso la racemasi e monitoro con un polarimetro
Elenco di esempi di saggi in continuo utilizzati?
- fumarato-idratasi: monitoro la scomparsa di fumarato (S che assorbe a 300nm)
- lattato-deidrogenasi: monitoro la scomparsa di NADH (cofattore che assorbe a 340nm)
Come posso fare un saggio in continuo di reazioni accoppiate?
- aconitasi: monitoro la comparsa di NADH grazie alla reazione accoppiata mediata da isocitrato deidrogenasi
- lattato deidrogenasi: monitoro la scomparsa di NADH che è associata alla produzione di ATP da parte della piruvato chinasi
Processo generale di un saggio in continuo?
1- preparo 6 campioni a concentrazioni crescenti di substrato
2- aggiungo enzima a condizioni fisse e cofattori a condizioni saturanti
3- costuisco una retta tempo/A: la velocità è proporzionale alla pendenza e il NADH è in rapporto 1:1 con l’enzima
Processo per un saggio in discontinuo?
1- preparo i campioni a concentrazioni crescenti di substrato, enzima fisso, cofattore saturante e tampone
2- scelgo T, tempi e pH
3- creo una retta di taratura con concentrazione di substrato/fluorescenza
4- quenching: blocco la reazione ai tempi stabiliti e misuro la fluorescenza
Che misure posso ottenere da un saggio in discontinuo?
- concentrazione di prodotto
- Vmax
- IC50: se metto substrato ad alte concentrazione e inibitore crescente
- Ki
Un esempio di reazione che posso monitorare con un saggio in discontinuo?
L’enzima NAMPT catalizza la sintesi del nicotinammide mononucleotide (NMN, non ha caratteristiche spettroscopiche o fluorimetriche) a partire dal NAM
Perchè non posso monitorare una proteina con meccanismo suicida con un saggio in continuo?
perché le condizioni di reazione cambiano ad ogni ciclo di reazione: il substrato resta attaccato all’enzima (c’è meno substrato) e c’è anche meno enzima disponibile al ciclo successivo.
Come posso monitorare una proteina con meccanismo suicida?
Faccio un saggio in discontinuo in cui
1- Creo campioni a concentrazione crescente di SNAP-Vista green
2- Per ogni campione effettuo un time-course: aggiungo l’enzima e lo faccio reagire con il substrato fluorescente.
3- Quenching di ogni campione: stoppo la reazione a tempi noti mediante aumento di temperatura. Faccio quindi 6 prelievi per ogni campione a tempi noti.
4- Creo una serie di curve tempo-risposta cioè quanta proteina viene modificata rispetto al tempo (grafico piccolo) sfruttando anche un’analisi SDS-page: ottengo bande fluorescenti ad intensità crescente
5- Calcolo la Kops cioè la costante di primo ordine che rappresenta la velocità e la comparo alla concentrazione di enzima-SNAP
Un esempio di proteina con meccanismo suicida che posso monitorare con un saggio in discontinuo?
SsOGT: un’alchil transferasi che lega il DNA rotto.
Se aggiungo ai campioni DNA metilato questo interferisce con la marcatura (+ DNA → – fluorescenza).
Ottengo quindi le curve a concentrazioni crescenti di DNA e posso rapportare la diminuzione di affinità con la concentrazione di DNA. Posso ottenere una retta che intercetta l’asse X in corrispondenza della costante di dissociazione (Kd).
Dato che il DNA lavora come inibitore, la Kd può anche essere considerata come Ki
Cosa permette di ottenere la cristallografia a raggi X
si ottengono dettagli atomici sulla posizione di una molecola nel sito di legame
Qual è la lunghezza d’onda dei raggi X e cosa mi permette di vedere?
0,1nm (1A)
Posso usarla per vedere legami covalenti (1-2A) o legami H (2,5-3A)
Che cos’è un cristallo?
è un’entità fisica con disposizione ordinata e periodica all’interno di un reticolo cristallino
Definizione di unità asimmetrica
La più piccola parte del cristallo che si ripete. Si può riconoscere un’origine
Cosa dice la legge di Bragg?
n lambda = 2d * sin(teta)
Questa legge definisce che in caso di interferenza costruttiva, la distanza percorsa dal raggio incidente è un multiplo della lunghezza d’onda
Che cos’è l’immagine di diffrazione?
è la somma dei raggi x diffratti dai piani che intersecano gli atomi della molecola nel reticolo
Cosa definisce la serie di Fourier?
ciascun riflesso corrisponde ad un’onda descritta da un’equazione Fhkl che è la sommatoria dei fattori di struttura dei singoli atomi.
L’equazione Fhkl descrive la posizione nello spazio del singolo atomo
Come posso risolvere il problema della fase?
Con la cristallografia non posso calcolare la fase, cioè l’angolo che l’onda disegna con il piano.
Per risolverlo posso fare:
- molecular replacement: sfrutto la struttura già risolta si una proteina simile
- inserisco il cristallo in mezzo ad atomi pesanti (Se) e produco la proteina in un terreno di selenio-metionina. Posso usare il Se per calcolare la fase
Come funziona il molecular replacement?
1- Indicizzo la raccolta dati
2- Carico i fattori di struttura e automaticamente il sistema prende il gruppo spaziale e le unità di cellula.
3- Bisogna poi inserire il peso molecolare o la sequenza o il pdb di un modello.
4- Dati questi valori, il sistema mi dice quante unità mi devo aspettare (coefficiente di Matthews), cioè quanto solvente ho nella soluzione.
Per avere una buona lettura serve una percentuale di solvente maggiore del 40%.
Se ottengo due diverse percentuali di solvente ma entrambe accettabili vuol dire che ci può essere un monomero o un dimero: il sistema dovrà roto-translare il sistema per cercare la struttura.
Il risultato del sistema sono amminoacidi inseriti con diverse sicurezze.
Perchè un cristallo è simmetrico?
Perchè l’unità di cellula può rototranslare rispetto ad assi di rotazione puri. Questi movimenti non è detto che siano quelli che la proteina fisiologica fa
Definizione di unità di cella
Il più piccolo gruppo di particelle che costituisce il pattern ripetuto del cristallo
