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Question 1

Definizione di unità enzimatica

Answer 1

quantità di enzima in grado di convertire 50 microM di substrato in 1 min a 25°

Question 2

Definizione di attività specifica di un enzima

Answer 2

unità enzimatica rapportata ai mg di proteina

Question 3

Definizione di saggio enzimatico

Answer 3

esperimento per misurare la comparsa di prodotto o la scomparsa di substrato in cui la concentrazione di enzima è irrilevante

Question 4

Per cosa posso utilizzare un saggio in continuo?

Answer 4

Per monitorare il real time la concentrazione di substrato sfruttando:
- fluorescenza
- chemiluminescenza
- assorbanza
- ddp
- produzione di gas: monitoro la pressione
- generazione di uno stereoisomero: uso la racemasi e monitoro con un polarimetro

Question 5

Elenco di esempi di saggi in continuo utilizzati?

Answer 5

• fumarato-idratasi: monitoro la scomparsa di fumarato (S che assorbe a 300nm)
• lattato-deidrogenasi: monitoro la scomparsa di NADH (cofattore che assorbe a 340nm)

Question 6

Come posso fare un saggio in continuo di reazioni accoppiate?

Answer 6

• aconitasi: monitoro la comparsa di NADH grazie alla reazione accoppiata mediata da isocitrato deidrogenasi
• lattato deidrogenasi: monitoro la scomparsa di NADH che è associata alla produzione di ATP da parte della piruvato chinasi

Question 7

Processo generale di un saggio in continuo?

Answer 7

1- preparo 6 campioni a concentrazioni crescenti di substrato
2- aggiungo enzima a condizioni fisse e cofattori a condizioni saturanti
3- costuisco una retta tempo/A: la velocità è proporzionale alla pendenza e il NADH è in rapporto 1:1 con l’enzima

Question 8

Processo per un saggio in discontinuo?

Answer 8

1- preparo i campioni a concentrazioni crescenti di substrato, enzima fisso, cofattore saturante e tampone
2- scelgo T, tempi e pH
3- creo una retta di taratura con concentrazione di substrato/fluorescenza
4- quenching: blocco la reazione ai tempi stabiliti e misuro la fluorescenza

Question 9

Che misure posso ottenere da un saggio in discontinuo?

Answer 9

• concentrazione di prodotto
• Vmax
• IC50: se metto substrato ad alte concentrazione e inibitore crescente
• Ki

Question 10

Un esempio di reazione che posso monitorare con un saggio in discontinuo?

Answer 10

L’enzima NAMPT catalizza la sintesi del nicotinammide mononucleotide (NMN, non ha caratteristiche spettroscopiche o fluorimetriche) a partire dal NAM

Question 11

Perchè non posso monitorare una proteina con meccanismo suicida con un saggio in continuo?

Answer 11

perché le condizioni di reazione cambiano ad ogni ciclo di reazione: il substrato resta attaccato all’enzima (c’è meno substrato) e c’è anche meno enzima disponibile al ciclo successivo.

Question 12

Come posso monitorare una proteina con meccanismo suicida?

Answer 12

Faccio un saggio in discontinuo in cui
1- Creo campioni a concentrazione crescente di SNAP-Vista green
2- Per ogni campione effettuo un time-course: aggiungo l’enzima e lo faccio reagire con il substrato fluorescente.
3- Quenching di ogni campione: stoppo la reazione a tempi noti mediante aumento di temperatura. Faccio quindi 6 prelievi per ogni campione a tempi noti.
4- Creo una serie di curve tempo-risposta cioè quanta proteina viene modificata rispetto al tempo (grafico piccolo) sfruttando anche un’analisi SDS-page: ottengo bande fluorescenti ad intensità crescente
5- Calcolo la Kops cioè la costante di primo ordine che rappresenta la velocità e la comparo alla concentrazione di enzima-SNAP

Question 13

Un esempio di proteina con meccanismo suicida che posso monitorare con un saggio in discontinuo?

Answer 13

SsOGT: un’alchil transferasi che lega il DNA rotto.
Se aggiungo ai campioni DNA metilato questo interferisce con la marcatura (+ DNA → – fluorescenza).
Ottengo quindi le curve a concentrazioni crescenti di DNA e posso rapportare la diminuzione di affinità con la concentrazione di DNA. Posso ottenere una retta che intercetta l’asse X in corrispondenza della costante di dissociazione (Kd).
Dato che il DNA lavora come inibitore, la Kd può anche essere considerata come Ki

Question 14

Cosa permette di ottenere la cristallografia a raggi X

Answer 14

si ottengono dettagli atomici sulla posizione di una molecola nel sito di legame

Question 15

Qual è la lunghezza d’onda dei raggi X e cosa mi permette di vedere?

Answer 15

0,1nm (1A)
Posso usarla per vedere legami covalenti (1-2A) o legami H (2,5-3A)

Question 16

Che cos’è un cristallo?

Answer 16

è un’entità fisica con disposizione ordinata e periodica all’interno di un reticolo cristallino

Question 17

Definizione di unità asimmetrica

Answer 17

La più piccola parte del cristallo che si ripete. Si può riconoscere un’origine

Question 18

Cosa dice la legge di Bragg?

Answer 18

n lambda = 2d * sin(teta)
Questa legge definisce che in caso di interferenza costruttiva, la distanza percorsa dal raggio incidente è un multiplo della lunghezza d’onda

Question 19

Che cos’è l’immagine di diffrazione?

Answer 19

è la somma dei raggi x diffratti dai piani che intersecano gli atomi della molecola nel reticolo

Question 20

Cosa definisce la serie di Fourier?

Answer 20

ciascun riflesso corrisponde ad un’onda descritta da un’equazione Fhkl che è la sommatoria dei fattori di struttura dei singoli atomi.
L’equazione Fhkl descrive la posizione nello spazio del singolo atomo

Question 21

Come posso risolvere il problema della fase?

Answer 21

Con la cristallografia non posso calcolare la fase, cioè l’angolo che l’onda disegna con il piano.
Per risolverlo posso fare:
- molecular replacement: sfrutto la struttura già risolta si una proteina simile
- inserisco il cristallo in mezzo ad atomi pesanti (Se) e produco la proteina in un terreno di selenio-metionina. Posso usare il Se per calcolare la fase

Question 22

Come funziona il molecular replacement?

Answer 22

1- Indicizzo la raccolta dati
2- Carico i fattori di struttura e automaticamente il sistema prende il gruppo spaziale e le unità di cellula.
3- Bisogna poi inserire il peso molecolare o la sequenza o il pdb di un modello.
4- Dati questi valori, il sistema mi dice quante unità mi devo aspettare (coefficiente di Matthews), cioè quanto solvente ho nella soluzione.
Per avere una buona lettura serve una percentuale di solvente maggiore del 40%.
Se ottengo due diverse percentuali di solvente ma entrambe accettabili vuol dire che ci può essere un monomero o un dimero: il sistema dovrà roto-translare il sistema per cercare la struttura.

Il risultato del sistema sono amminoacidi inseriti con diverse sicurezze.

Question 23

Perchè un cristallo è simmetrico?

Answer 23

Perchè l’unità di cellula può rototranslare rispetto ad assi di rotazione puri. Questi movimenti non è detto che siano quelli che la proteina fisiologica fa

Question 24

Definizione di unità di cella

Answer 24

Il più piccolo gruppo di particelle che costituisce il pattern ripetuto del cristallo

Question 25

Definizione di indexing

Answer 25

calcolo dell’unità asimmetrica e dell’unità di cella da parte di un software

Question 26

Quali condizioni specifiche devo avere perchè la proteina possa cristallizzare?

Answer 26

• alta purezza
• alte concentrazioni di proteina
• proteina stabile
• no contaminanti
• temperatura costante
• nessuna vibrazione dei macchinari

Question 27

Come posso far cristallizzare una proteina?

Answer 27

Per ottenere cristalli bisogna
1- Ottenere la proteina: la produco con DNA ricombinante
2- Rimuovo il solvente per ottenere uno standard cristallografico di purezza (99%): posso farlo evaporare con metodo sitting drop o hanging drop. I cristalli di sale sono sul fondo, i cristalli di proteina su diversi piani focali, fragili e blu sotto UV
3- Controllo con SDS page

Question 28

Come è fatta una proteina intrinsecamente disordinata

Answer 28

Presenta zone altamente flessibili che non possono essere cristallizzate e un livello di disordine da 0 a 7 con profondità varia.
Hanno amminoacidi polari e flassibili

Question 29

Come posso riconoscere una proteina intrinsecamente disordinata?

Answer 29

• elettroforesi: tanti aa disordinati causano meno incorporazione di SDS
• proteasi: sono ipersensibili alle proteasi
• analisi idrodinamica: hanno raggio di strokes maggiore quindi migrano meno
• alphafold

Question 30

Qual è un ruolo delle proteine intrinsecamente disordinate?

Answer 30

Possono legare l’mRNA o il DNA e localizzarlo in zone specifiche

Question 31

Quali sono gli output della SAXS?

Answer 31

• dimensioni di una particella
• forma (allungata, circolare…)
• grado di dispersione (omogeneità delle particelle nel campione)
• morfologia (es: globulare con zone disordinate

Question 32

Quali sono le condizioni perchè la SAXS funzioni e restituisca risultati corretti?

Answer 32

il campione deve essere monodisperso e bisogna sempre sottrarre la curva di scattering del solvente

Question 33

Qual è il meccanismo di funzionamento della SAXS?

Answer 33

le particelle interagiscono tra loro e posso ottenere la nube elettronica usando la trasformata di Fourier e la distribuzione di cariche

Question 34

Che calcoli posso fare a partire dai risultati della saxs?

Answer 34

• pair distance distribution: creo una curva gaussiana la cui base è il diametro massimo e che posso usare per fare model building (disegno)
• calcolo del raggio di girazione: uso l’approssimazione di guinier per linearizzare la curva di scattering
• Kratky plot: ottengo un grafico che mi dà un’idea della morfologia della molecola in termini di folding (disegno)
• ab-inition structure determination: modelling senza bias a partire dalla densità elettronica

Question 35

Come è fatto il Monolit?

Answer 35

ha una cassetta con 14 microcapillari con concentrazione fissa di proteina e variabile di analita.
C’è poi un laser che causa un aumento della temperatura

Question 36

Processo per la microscale thermophoresis

Answer 36

1- proteina nel solvente senza analita
2- accendo il laser, le molecole si disperdono e la fluorescenza crolla visto che si allontanano dal rilevatore
3- aggiungo l’analita
4- riaccendo il laser e misuro la diminuzione di fluorescenza (visto che i complessi hanno meno mobilità)

Question 37

Cosa posso valutare con la microscale thermophoresis?

Answer 37

posso misurare interazioni proteina-proteina o proteina-DNA e calcolare la Kd (dato che ho una variazione nell’ambiente dopo il binding)

Question 38

Che cos’è la termoforesi?

Answer 38

è il movimento delle molecole in un gradiente di temperatura.
è direttamente collegata a massa, carica e conformazione della molecola

Question 39

Quali sono gli svantaggi della microscale thermophoresis?

Answer 39

Il campione non deve contenere gruppi amminici perchè altrimenti ci si potrebbe attaccare il tag

Question 40

Cosa misuro con la isothermal titration calorimetry?

Answer 40

misuro il calore rilasciato o assorbito quando due molecole interagiscono

Question 41

Processo della isothermal titration calorimetry?

Answer 41

1- inserisco la proteina A in una camera di reazione
2- inserisco nella siringa una concentrazione saturante di proteina B
3- aggiungo progressivamente la proteina A alla proteina B
4- misuro la variazione di T nella reference cell (grafico a iperbole)

Question 42

Che misure ottengo della isothermal titration calorimetry?

Answer 42

Kd
entalpia
entropia
stechiometria di reazione