Pag 7-12 Flashcards
Come posso far produrre a un batterio la mia proteina di interesse?
- Seleziono una proteina di un certo organismo
- Cerco la sequenza genica
- Scelgo un vettore plasmidico: con poli-linker e resistenza all’antibiotico
- Taglio con gli stessi enzimi di restrizione (BamH1 e EcoR1): inserisco anche un HisTag separato dalla proteina da un sito di taglio, e un codone di stop (taglio-tag-taglio-proteina-stop-taglio)
- Disegno due primer
- Forward: taglio-sequenza
- Reverse: taglio-stop-sequenza
Non li posso usare direttamente perché il DNA andrebbe incontro a splicing - Uso una resina di Poly-T per catturare l’mRNA
- Trasformo l’mRNA in cDNA mediante trascrittasi inversa
- Faccio una PCR sul cDNA
- Faccio ligazione nel plasmide e lo inserisco in un ceppo di E.Coli.
Quali sono i materiali necessari per far partire una PCR?
- DNA polimerasi
- Oligonucleotidi di innesco (primers)
- Miscela di dNTPs
- DNA stampo
- Buffer di reazione: ioni magnesio necessari per verificare che la PCR abbia lavorato correttamente
- Termociclatore
Quali sono gli step della PCR?
- denaturazione stampo a 90° per 30/60”
- annealing dei primer a t specifica per 30/60”
- elongazione del dna
Se effettuo una corsa elettroforetica che plasmide uso?
Serve una forma lineare.
Una forma rilassata è troppo lenta mentre superavvolta è troppo veloce, entrambe garantiscono inoltre resistenza ai marker
Cosa deve contenere un vettore ricombinante?
- ori specifica del batterio
- marker di selezione -> antibiotico o gene per la beta galattosidasi
- dna esogeno
- ribosome binding site
- sequenze poli-linker per enzimi di trascrizione
Che cos’è un vettore policistonico?
è un vettore ricombinante che contiene più di un gene esogeno
Quali metodi posso utilizzare per ottenere un dna ricombinante ?
- parto dall’mRNA, ottengo il cDNA, lo inserisco in un vettore
- overlap extension PCR: uso primer per pcr che contengono il gene di interesse
- self labelling protein tag: per ottenere una proteina fluorescente, faccio reagire la proteina con meccanismo suicida con la fluoresceina
- random mutagenesis
- polimerasi error-prone
Come posso capire se una proteina wt e una mutata hanno lo stesso folding?
Posso confrontare le T melting
Dopo la trasformazione di un batterio, come posso essere sicura che venga espresso solo il dna ricombinante?
Posso usare l’enzima DPN1 che digerisce il dna metilato (wt è metilato, da pcr no).
Posso inserire nel batterio una resistenza non presente nei wt
Come fa alphafold a determinare la struttura 3d di una proteina?
usa algoritmi per allineare e confrontare sequenze aminoacidiche, c’è sempre un utilizzo delle strutture già presenti in letteratura. Dispone prima i C della catena principale e poi quelli delle catene laterali
Quali sono i limiti di alphafold?
non predice strutture multimeriche e non predice l’interazione proteina -ligando o proteina-cofattore
Esempi di enzimi risolti grazie ad alphafold?
glucosio-6-fosfatasi: sono state trovate le cariche nel sito attivo e un sito di legame con l’ER
diacilglicerolo-O-aciltransferasi 2: è stata individuata la tasca di legame per un inibitore
Quali sono le componenti di un FPLC?
o Sistema di pescaggio della fase mobile: due pompe peristaltiche inviano la soluzione in un sistema di mixer e successivamente nella colonna
o Colonna cromatografica
o Collettore di frazioni: ciò che eluisce viene monitorato da un detector dell’assorbanza generalmente a 280nm (lunghezza d’onda tipica degli amminoacidi aromatici). Se so che la proteina lega un cofattore (NAD, PLP…) posso monitorare la λ caratteristica del cofattore.
Qual è l’output di un cromatografica FPLC?
ottengo un cromatogramma
disegno
Come posso preparare un campione per FPLC?
- Prendo 1ml di terreno di crescita: ho un insieme di cellule sospese in un terreno
- Faccio una centrifugazione (solitamente a 8000rpm) ed elimino il surnatante in modo da ottenere solo le cellule (pellet batterico)
- Risospendo il pellet in un buffer di lisi
- Effettuo n cicli di sonicazione fino ad ottenere la lisi di tutte le cellule in soluzione: ottengo un lisato con frazione solubile (SN), frazione insolubile e residui
- Carico il campione su gel
- Se la banda è spessa allora la concentrazione della proteina è elevata
- Prendo il lisato (T) e lo centrifugo a 18000rpm
- Prelevo il surnatante (SN)
- Analizzo il pellet (frazione insolubile) risospeso in un tampone (P)
- Carico tutto su gel: dall’immagine capisco che la proteina è tutta nella frazione insolubile
Nella cromatografia di affinità, cosa determina la separazione della proteine?
le proteine si separano in base alla capacità di reagire con la resina
Nella cromatografia di affinità, che tag posso usare?
- Segmenti di poli-istidina: sono a 6 o 10 istidine, non serve che vengano rimossi quando si purifica la proteina perché non impattano sulla struttura.
- GST (glutation-S-transferasi): lega in maniera specifica il glutatione presente sulla resina. Aggiungo il gene di GST all’N terminale del gene della proteina di interesse, separato da una sequenza di taglio che poi verrà usata per rimuoverlo
Il GST è anche altamente solubile quindi migliora la solubilità della proteina di interesse - SNAP tag: sono proteine con meccanismo suicida legate irreversibilmente catene alifatiche con alogenuri, si trovano sulla fase stazionaria. Le proteine eliminano l’alogenuro e restano attaccate covalentemente al tag.
