Quiz 2a generación Flashcards
(24 cards)
¿Qué es Helicos?
Single molecule sequencing chemistry
¿En qué se basa Helicos?
Se basa en la secuenciación de moleculas independientes de ADN. No se hace PCR
¿Cómo se hace Helicos?
- Fragmentación de DNAg por metodo ultrasónico
- Poliadenilación
- Adición de adenina marcada con fluroforo
- Síntesis de cDNA
- Eliminación de la cadena de RNA
- Adicion de cola poly-A
- Adición de adenina
- Hibridación a la base
- Adición de nucleotido
- Lavado
11: Excitación de fluoroforo - Agregar siguiente nucleótido
¿Cuál es el método de secuenciación de Pacific?
Pacific Biosciences desarrolló SMRT, Single Molecule Real Time Sequencer
¿Cuál es la base de SMRT?
Se basa en inmobilizar la polimerasa en cilindros independientes que favorecen la secuenciacion de una molecula a la vez
¿Qué son las placas de SMRT?
Se llaman ZMW, Zero Mode Waveguide y cada pozo es una camara de visualizacion nanofotonica. Los volumenes son tan pequeños que permiten detectar solo la emision de fluorescencia de una molecula. Están fabricadas en película de metal sobre sustrato de dióxido de silicón.
¿Cuál es la diferencia de marcaje de SMRT?
Los nucleótidos están etiquetados de tal forma que la reacción con polimerasa libera una señal fluorescente, se llaman phospholinked nucleotides
¿Cuántos ZMW se pueden detectar al mismo tiempo?
Hasta 75,000
Pro de SMRT
Permite la obtención de lecturas más largas
¿Cómo se hace SMRT?
- Fragmentación de DNA
- Reparación de extremos
- Ligación de adaptadores
- Purificación
- Secuenciar
¿Qué moleculas se pueden acoplar co SMRT?
Polimerasa, reversa transcriptasa, ribosoma.
¿Cómo se hace ION Torrent?
- Preparar la libreria
- Acoplar a perlas magnéticas
- secuenciar en el chip
- Procesamiento de datos
¿Qué hace a ION Torrent especial?
Se adicionan las bases por separado y despues de cada adición se hace un lavado
¿En qué consiste Nanopore Sequencing?
Son agujeros muy pequeños que cuando se sumergen en un fluido condictor y se aplica voltaje, se puede observar una pequeña corriente. Los cambios de corriente identifican cada base y no hace falta hacer PCR
¿En qué se basa Nanopore Sequencing?
Se basa en la formación de poros con toxina alfa-hemolisina, No requiere de librerías con adaptadores. No requiere fluoroforos. No usa sintesis o ligación y permite lecturas largas
¿Cómo se puede mejorar Nanopore?
Detección de nucleótido mediante la detección de la base.
Hacer más lento el paso para poder detectar
Métodos de Nanopore desarrollados por Oxford
Strand Sequencing
Exonuclease sequencing
¿En qué consiste Strand Sequencing?
Técnica que hace posible que una molécula atraviese el nanoporo con uso de polimerasa
¿En qué consiste Exonuclease Sequencing?
Técnica que utiliza exonucleasa procesiva para degradar la cadena de DNA en nucleótidos sencillos
¿Qué es un microarreglo?
Soportes sólidos con miles de genes inmovilizados de manera ordenada
¿Qué materiales se ocupan para microarreglos?
Laminillas de vidrio
Laminillas de silicón
Membranas de nylon
¿Cómo se crea un microarreglo?
El DNA puede ser impreso, depositado o sitetizado sobre la superficie y despues de fija horneando a 80°C por 4 hrs o un entrecruzador de luz UV
¿Qué clases de microarreglos hay?
Contacto: Deposita las muestras haciendo contacto
Piezoelectricos: Aplicador ultrasónico deposita la muestra
Impresión: Síntesis de DNA directamente sobre superficie
Procedimiento para experimento con microarreglo
- Diseño de microarreglo
- Fabricación de microarreglo
- Extracción y marcado
- Hibridación
- Lectura del arreglo
- Cuantificación del arreglo
- Normalización de datos
- Analísis de datos
