Random Flashcards
(25 cards)
Čo je soforolipid?
Soforolipidy sú povrchovo aktívne glycolipidy, ktoré v priemyselnom meradle produkujú hlavne nepatogénne kvasinky (napr. Candida bombicola či Starmerella bombicola). Molekula pozostáva z hydrofilnej hlavičky – disacharidu sophorózy (β-1,2-vazba medzi dvoma glukózami) – a hydrofóbneho hlavenia, t. j. 16–18-uhlíkového mastného chvosta, ktorý môže byť vo forme voľnej (acidickej) alebo uzavretej (laktónovej)
Využitie soforolipidu pri príprave bioaróm.
Soforolipidy sú biosurfaktanty s vysokou povrchovou aktívnosťou a špecifickou štruktúrou (sophoróza + mastný chvost), ktoré sa v bioarómach využívajú najmä na:
tvorbu stabilných vodných emulzií esenciálnych olejov,
mikroenkapsuláciu krehkých aróm (napr. limonén, citronelol, benzyl salicylát),
ochranu voči oxidácii a regulovaný uvoľňovací efekt v potravinárskych či parfumérnych aplikáciách.
Aké faktory ovplyvňujú peletálny rast?
- Hydrodynamika a miešanie
Typ fermentora (batch, fed-batch, airlift) a dizajn miešadla určujú šmykové sily, ktoré fragmentujú mycélium a formujú pelety.
Intenzita a režim vetrania ovplyvňujú rýchlosť rastu a agregáciu hyf.
- Kultivačné podmienky
pH: optimálne pásmo (zvyčajne 5,0–7,0) podporuje tvorbu peliet; pri pH mimo tohto rozsahu môže dochádzať k nepravidelnej agregácii alebo povrchovému rastu.
Teplota: každý kmeň má vlastné optimum (často okolo 28–32 °C), ktoré ovplyvňuje viskozitu média aj fluidné vlastnosti peliet.
- Zloženie média
Koncentrácia substrátu (cukry, proteíny) a viskozita média (prítomnosť melasy či polysacharidov) menia difúzne bariéry v peletoch a vnútorne vrstvy mycélia.
Iónový pomer (stopové prvky Fe, Zn, Co, Ni, Cu) reguluje aglutináciu hyf a morfogenézu peliet.
- Inokulum
Koncentrácia a stupeň klíčenia spór (resp. fragmentov mycélia): vyššia hustota inokula vedie k menším a početnejším peletám, nižšia k väčším aglomerátom.
Vek inokula (čerstvé vs. staršie kultúry) mení schopnosť agregácie a rýchlosť rastu.
- Genetické a fyziologické vlastnosti kmena
Rôzne kmene alebo mutanti disponujú odlišnou afinitou k tvorbe extracelulárneho polysacharidu, ktorý „lepí“ hyfy dohromady.
Produkčný kmeň môže byť modifikovaný tak, aby preferoval pelletový rast (napr. znížená tvorba proteáz či modifikované povrchové proteíny).
Dva príklady biotransformácií s kvasinkami
Produkcia fenylacetylkarbinolu (PAC)
Sacharomyces cerevisiae katalyzuje kondenzáciu benzaldehydu s „aktívnym acetátom“ (pochádzajúcim z pyruvátu) za vzniku fenylacetylkarbinolu, medziproduktu pri syntéze opticky aktívneho L-efedrínu či fenmetrazínu. Proces prebieha v aeróbnej submerznej kultúre, po separácii biomasy sa produkt extrahuje butylacetátom, koncentruje a upravuje ďalšími chemickými krokmi .
Asymetrická redukcia acetofenónu na 1-fenylethanol
Vybrané kvasinky (napr. Candida parapsilosis, Brettanomyces naardenensis) v tlmivom roztoku redukujú acetofenón na (S)-1-fenylethanol. Po kultivácii a indukcii enzymatických systémov sa substrát pridáva k biomase pri pH 7 a 30 °C, čím vzniká vysoko opticky čistý alkohol používaný v parfumérii, farmácii či agrochemikáliách .
Tri hlavné rozdiely medzi dextránom a xylánom
Monosacharidová jednotka
Dextrán je homopolymér tvorený opakujúcimi sa jednotkami α-D-glukózy.
Xylán je heteropolysacharid, ktorého hlavný reťazec tvorí β-D-xylopyranóza (xylóza) a často nesie postranné reťazce arabinózy alebo glukurónovej kyseliny.
Typ väzieb
Dextrán má primárne α-(1→6) väzby medzi glukózovými jednotkami a vetví sa cez α-(1→3), α-(1→4) alebo α-(1→2) väzby.
Xylán je lineárny reťazec spojený β-(1→4) väzbami medzi xylózovými jednotkami; v heteroxylánoch sú na túto kostru naviazané postranné skupiny cez α-(1→2) alebo α-(1→3) väzby.
Pôvod a využitie
Dextrán sa syntetizuje extracelulárne baktériami rodu Leuconostoc (napr. L. mesenteroides) a používa sa ako náhrada krvnej plazmy, ako antikoagulans a potravinársky stabilizátor.
Xylán je hlavnou hemicelulózou buniek rastlín (najmä tráv a listnatých drevín) a nachádza uplatnenie pri výrobe papiera, biopalív a ako zdroj prebiotických xylooligomérov.
Funkcia bunkovej membráne
Oddelenie prostredí, selektívna permeabilita a transport látok, signalizácia a komunikácia, udržiavanie tvaru a stability, homeostáza vnútorného prostredia
Porovnanie transportov cez membránu.
Pasívna (jednoduchá) difúzia
Pri pasívnej difúzii sa molekuly pohybujú priamo cez lipidovú dvojvrstvu v smere svojho (elektro)chemického gradientu bez účasti transportných proteínov a bez spotreby energie. Tento proces je neselektívny a prebieha až do dosiahnutia termodynamickej rovnováhy; malé nepolárne molekuly (O₂, CO₂) sa rozpúšťajú v lipidovej fáze, hydrofilné ióny prechádzajú prostredníctvom štandardných iónových kanálov, no rýchlosť transportu rastie priamoúměrne koncentrácii substrátu a nie je limitovaná žiadnym transportným mechanizmom .
Uľahčená difúzia (prenášačový transport)
Tento typ pasívneho transportu využíva špecifické membránové nosičové proteíny, ktoré sa viažu na transportovanú molekulu a po konformačnej zmene ju presunú na druhú stranu membrány. Hoci sa energia nedodáva priamo (nenaráta sa spotreba ATP), proces má kinetické vlastnosti enzymatickej reakcie (saturácia pri vyšších koncentráciách, Km, kompetitívna či nekompetitívna inhibícia) a môže byť blokovaný ťažkými kovmi, ale nie inhibítormi energetického metabolizmu .
Primárny aktívny transport
Tu prebieha presun iónov alebo malých molekúl proti ich koncentráčnému gradientu za priamého využitia energie z ATP. Kľúčovými proteínmi sú membránové ATP-ázy (H⁺-, Na⁺-, K⁺-, Ca²⁺-pumpy), ktorých aktivita môže byť inhibovaná nielen ťažkými kovmi, ale aj látkami blokujúcimi bunkový energetický metabolizmus. Príkladom je udržiavanie extrémne odlišných pomerov iónov sodíka a draslíka medzi vnútrom a vonkajškom bunky (pomery až 1 : 1000) .
Sekundárny aktívny transport
Energiu na prenášanie látok proti gradientu tento mechanizmus čerpá z elektrochemického protónového (resp. iónového) gradientu vytvoreného primárnym aktívnym transportom. Baktérie napríklad využívajú protónový gradient generovaný dýchacím reťazcom na pohon symportov (súčasný prenos protónu a substrátu rovnakým smerom) či antiportov (protóny a substrát putujú opačne) bez priamej spotreby ATP
.
Transport spojený s membránovými reakciami
Niektoré baktérie využívajú špecifický fosfotransferázový systém (PTS) na import cukrov, kde substrát počas transportu prechádza fosforyláciou zo zdrojov fosfátov v bunkovej cytoplazme.
Bulk transport (endo-/exocytóza)
V eukaryotoch sa väčšie molekuly či častice prenášajú formou pinocytózy (údaj tekutín) alebo fagocytózy (pevné častice). Bunková membrána sa pri tom aktívne obklopí substrátom, vytvorí vezikuly a následne ich fúziu s endozómami či lyzozómami riadi cytoskelet a ATP-závislé procesy .
Cytosolové vs. membránové dehydrogenázy
Cytosolové dehydrogenázy sa nachádzajú v cytosole a sú závislé na voľných koenzýmoch NAD⁺/NADP⁺. Katalyzujú dehydrogenáciu (resp. redukciu) substrátu ešte pred jeho fosforyláciou a reakcia môže byť vratná. Nevýhodou pri biotechnológii je, že produkty často okamžite vstupujú do ďalšej disimilácie, čo predstavuje straty v výťažku .
Membránové dehydrogenázy sú viazané na cytoplazmatickú membránu a pôsobia na substrát extracelulárne, bez potreby pridávania externého koenzýmu. Substrát sa často transportuje do periplazmatického priestoru (niekedy po permeabilizácii buniek) a elektróny putujú priamo do bunkového dýchacieho reťazca. Vďaka zjednodušenému mechanizmu a širokej špecificite týchto enzýmov sú produkčné kmene Acetobacter a Gluconobacter priemyselne mimoriadne využívané .
Tri priemyselné aplikácie s dehydrogenázami v Acetobacter
Oxidácia etanolu na kyselinu octovú
Acetobacter sp. (napr. A. aceti, A. pasteurianus) využíva na povrchu bunkovej membrány viazanú alkoholdehydrogenázu, ktorá oxiduje etanol na acetaldehyd, a následne acetaldehyddehydrogenázu, ktorá vytvára octovú kyselinu. Produkčné kmene sú striktne aeróbne, pretože elektróny z dehydrogenázy putujú do dýchacieho reťazca za spotreby kyslíka .
Výroba kyseliny D-glukónovej
Hoci najbežnejšie sa na to používa glukózaoxidáza z vláknitých húb, Acetobacter (a najmä Gluconobacter) vie pomocou membránovej glukózadehydrogenázy (GDH) priamo oxidovať D-glukózu na D-glukónovú kyselinu, ktorá je ďalej využiteľná napr. ako prekurzor kyseliny L-askorbovej. Pre optimálnu činnosť týchto dehydrogenáz je nevyhnutná intenzívna aerácia .
Syntéza L-sorbózy zo sorbitolu
Acetobacter suboxydans používa membránovo viazanú sorbitoldehydrogenázu (SDH) na selektívnu oxidáciu D-sorbitolu na L-sorbózu (medziprodukt pri výrobe kyseliny L-askorbovej). Substrát sa prídavkami udržiava postupne, aby sa zabránilo tvorbe vedľajších produktov (napr. fruktózy) .
Citlivosť Acetobacter pri submerznej výrobe octu na nedostatok O₂
Acetobacter sú striktne aeróbne baktérie, ktoré na membránových dehydrogenázach oxidujú etanol tak, že elektróny uvoľnené pri tejto reakcii vstupujú priamo do bunkového dýchacieho reťazca. Kyslík slúži ako konečný akceptor elektrónov a zároveň podporuje regeneráciu koenzýmov a tvorbu protonového gradientu, ktorý poháňa syntézu ATP. Pri nedostatku O₂ klesá rýchlosť prenosu elektrónov, čo vedie k:
Zníženiu aktivity alkoholdehydrogenázy – spomalená oxidácia etanolu na acetaldehyd.
Narušeniu dýchacieho reťazca – slabšia regenerácia koenzýmov a produkcia ATP, bunky prestávajú mať dostatok energie na rast a udržiavanie metabolizmu.
Tvorbe toxického acetaldehydu – ak acetaldehyddehydrogenáza nefunguje dostatočne rýchlo, acetaldehyd sa hromadí a inhibuje bunkovú aktivitu.
Preto submerzné procesy výroby octu vyžadujú veľmi intenzívne vetranie a miešanie, aby sa zabezpečila dostatočná zásoba rozptýleného kyslíka v celom objeme fermentora
Čo je to permeabilizácia a na čo slúži?
Permeabilizácia je proces, pri ktorom sa cielene zvyšuje priepustnosť bunkovej membrány pre substráty, produkty či makromolekuly, pričom sa zachováva aspoň čiastočná životaschopnosť buniek. Umožňuje to efektívnejšie dodanie alebo uvoľnenie látok bez úplnej dezintegrácie buniek .
Na čo slúži:
Zlepšenie prístupu intracelulárnych enzýmov k vonkajším substrátom pri biotransformáciách.
Uvoľnenie vysoko hodnotných intracelulárnych produktov (enzýmov, polymérov) bez úplného rozbitia buniek.
Štúdium intracelulárnych mechanizmov a dávkovanie látok do buniek v biochemických experimentoch.
Metódy permeabilizácie
Fyzikálne: ultrazvuk (ultrasonikácia) pre dočasné porušenie membrány a prienik makromolekúl .
Chemické: organické rozpúšťadlá (napr. toluén, DMSO), detergenty alebo chelátory. Toluén pri vhodnej koncentrácii uvoľní až 25 % celkových proteínov, DMSO vytvára v membráne dočasné kanály .
Biochemické: exogénne proteíny či polypeptidy (napr. lysolecitín pre živočíšne bunky), ktoré interagujú elektrostaticky s membránou a tvoria póry
Tri príklady využitia permeabilizácie:
Biotransformácia cis-epoxyjantaran → kyselina vínna
Pri príprave kyseliny vínej pomocou Nocardia tartaricans sa pridáva 0,02 % sodného deoxycholátu (detergent), aby sa zvýšila priepustnosť bunkovej membrány pre substrát a enzým cis-epoxyjantaranhydrolázu, čím sa dosahuje vyššia aktivita a stabilita pri opakovaných konverziách
Uvoľnenie intracelulárnych enzýmov
Ultrasonikáciou sa permeabilizujú baktérie alebo kvasinky, aby bolo možné extrahovať a purifikovať intracelulárne enzýmy (napr. laktátdehydrogenázu) bez potreby tvrdých mechanických metód, čo šetrí čas aj energiu
Príprava permeabilizovaných kvasiniek na biotransformácie
DMSO sa pridáva do suspenzie kvasiniek (Saccharomyces spp.) na tvorbu kanálov v membráne, čo umožňuje vstup hydrofóbnych substrátov (napr. steroidov) do cytosolu a efektívnu katalýzu enzýmami v bunke
Produkciu ktorých látok možno detegovať pri raste na tuhých médiach? Aké podmienky detekcie .
Pri kultivácii mikroorganizmov na tuhých médiách (napr. na agare) možno rýchlo detegovať niekoľko hlavných skupín produktov a to za špecifických podmienok:
Organické kyseliny
– Prítomnosť kyselín sa zobrazuje zmenou farby pH indikátorov v médiu, napr. brómkrezolovej zelene, ktorá pri poklese pH (produkcia kyselín) prechádza zo zelenej na žltú. Tento test sa napríklad využíva pre screening kmeňov produkujúcich kyselinu kojovú prítomnosťou Cu²⁺ (kyselina vstupuje do komplexu) .
Hydrolytická aktivita enzýmov
Proteázy rozkladajú bielkoviny v médiu (napr. kazeínové agary) za vzniku čírych zón okolo kolónií; rozlišujeme kyslé (pH 2–5), neutrálné (pH ∼7) a alkalické proteázy (> pH 7) podľa optimálneho pH aktivity .
Amylázy štiepia škrob (škrobový agar), po pridaní jódového roztoku vznikajú číre zóny okolo kolónií indikujúce tvorbu maltózy či oligosacharidov .
Celulázy štiepia celulózu v médiu; pridaním farbiva (napr. Congo Red) sa po premytí NaCl získajú číre halo zóny
Antimikrobiálne látky (antibiotiká)
– Produkcia antibiotík sa deteguje komínkovou metódou, pri ktorej sa testované kolónie pestujú na tuhých médiách v strede platne a následne sa plocha preoseje senzibilnými baktériami; vznik zón nevývoja susedných baktérií signalizuje produkciu aktívnej látky
Pigmenty a exopolysacharidy
– Niektoré kmene tvoria charakteristické pigmenty (farbivosť kolónií: červená, zelená, žltá), prípadne slizové polysacharidy viditeľné ako lepivý povlak na povrchu kolónií
Podmienky detekcie
Výber média: média obohatené o špecifický substrát (škrob, kazeín, celulóza) a prípadne indikátor (jód, Congo Red, pH indikátor).
pH a teplota: optimálne pre daný enzým či metabolit (napr. proteázy pH 2–10, amylázy pH 4–7, teplota 30–37 °C).
Inkubačný čas: zvyčajne 24–72 h, podľa rýchlosti rastu a sily produkcie.
Použitie detekčných činidiel: jódový roztok pre škrob, brómkrezolová zelen pre kyseliny, farbivá ako Congo Red pre celulózu, a kultivačné testy pre antibiotiká (komínková metóda).
Takto možno na tuhých médiách jednoducho a rýchlo screeningovo identifikovať kmene so žiadanou aktivitou alebo produkciou metabolitov bez potreby kvapalných fermentácií či zložitých analytických prístrojov.
6 látok ktoré sa vyrábajú z glycerolu.
Dihydroxyacetón (DHA)
Glycerol sa membránovou glyceroldehydrogenázou oxiduje na dihydroxyacetón pri aeróbnej biotransformácii s baktériami rodu Gluconobacter alebo Acetobacter (substrát 5–20 % prítokovo, pH 5,3–5,5, T 25–30 °C). Izolácia zahŕňa ultrafiltráciu biomasy, aktívne uhlie, vákuové odparovanie a kryštalizáciu z etanolu .
1,3-Propándiol (1,3-PDO)
V mikroaerofilných či anaeróbnych podmienkach redukujú Klebsiella pneumoniae a Clostridium butyricum glycerol cez 3-hydroxypropionaldehyd na 1,3-propándiol. Po fermentácii sa produkt oddeľuje ultrafiltráciou, demineralizáciou a destiláciou .
Kyselina citrónová
Niektoré kmene kvasiniek Yarrowia lipolytica dokážu pri limitácii dusíka a silnej aerácii využívať glycerol ako zdroj uhlíka na vysokoprodukčnú biosyntézu citrátu, podobne ako Aspergillus spp. pri sacharidových substrátoch .
Kyselina itakónová
Hoci je najčastejšie produkovaná z glukózy kmeňom Aspergillus terreus, rastúce štúdie ukazujú možnosť fermentácie aj na glycerolových médiách, čím sa rozširuje spektrum surovín pre tento biopolymér
Kyselina jantárová (succinová)
Glycerol sa môže premeniť na kyselinu jantárovú v rekombinantných bakteriálnych alebo kvasinkových systémoch (napr. Escherichia coli so zavedenými cestami), pričom ide o perspektívnu náhradu tradičného glukózového substrátu
Kyselina propiónová
V niektorých fermentačných procesoch slúži glycerol ako substrát pre Propionibacterium spp., ktoré ho disimilujú na propionát. Tento prístup predstavuje ekologickú alternatívu k petrochémii
Prečo lactobacillus a Bacillus coagulans tvoria L aj D kyselinu mliečnu + 2 hlavné rozdiely v ich použití.
Lactobacillus sp. i Bacillus coagulans produkujú oba enantioméry kyseliny mliečnej preto, lebo v ich genóme nájdeme dva rôzne typy laktátdehydrogenáz (LDH), ktoré sú stereospecifické – jedna redukuje pyruvát na L-laktát, druhá na D-laktát. Týmto spôsobom si bunky zabezpečujú flexibilné vyrovnávanie redoxného stavu (regeneráciu NAD⁺/NADH) v závislosti od okolností fermentácie.
Produkční mikroorganizmy
– Lactobacillus sp. (napr. L. casei, L. brevis, L. bulgaricus) produkujú zmes L(+)- a D(–)-kyseliny mliečnej .
– Bacillus coagulans je termofilný, fakultatívne anaeróbný sporulujúci druh, tiež produkuje L(+)- aj D(–)-izomér .
Dva hlavné rozdiely v ich použití
Optimalizácia fermentácie a procesná odolnosť
Lactobacillus spp. sú väčšinou mezofilné (33–38 °C) a citlivejšie na výkyvy pH a teploty, preto sa používajú v tradičných potravinárskych fermentáciách (jogurty, syry, fermentovaná zelenina).
B. coagulans má optimálnu teplotu 50–55 °C, tvorí spóry a znáša pH 2,2–5,3, čo umožňuje jeho využitie v kontinualizovaných vysokoteplotných procesoch výroby kyseliny mliečnej (napr. pre bioplasty, PLA) a v prostredí, kde by Lactobacillus uhynul
Aplikačné spektrum a formy produktu
Kultúry Lactobacillus sa často dodávajú „živé“ ako probiotiká do potravín a doplnkov stravy, kde musí zachovať životaschopnosť.
B. coagulans vďaka sporulácii vytvára odolnejšie prípravky (spórové probiotiká), vhodné na farmaceutické doplnky a kŕmne prísady, kde musí prežiť spracovanie (teplo, kyselina žalúdka) a skladovanie.
Ako priemyselne separujeme z média vláknité huby, baktérie a kvasinky.
Priemyselná separácia bunkovej biomasy z kvapalného fermentačného média sa líši podľa typu mikroorganizmu a jeho morfológie:
- Vláknité huby
Vláknité huby (mycéliálne tvary) vytvárajú vo fermentore vláknité agregáty alebo pelety, ktoré sú relatívne veľké a pevné. Na ich oddelenie sa najčastejšie používajú:
Rotačné vákuové filtre (belt či drum filters), kde sa fermentačná kaša nanáša na pohybujúci sa pás alebo valec a tekutina sa odsáva vákuom. Táto metóda umožní rýchle oddelenie veľkého objemu mycélia aj pri vysokej viskozite média.
Tlaková filtrácia (pressure leaf or candle filters), kde pretláčaním média cez porézne elementy zachytávame vláknité časti mycélia.
- Baktérie
Baktérie sú v porovnaní s hubami oveľa menšie a často menej agregujú, preto sa pri ich separácii používajú jemnejšie metódy:
Odstreďovanie (centrifugácia) – kontinuálne diskové separátory (dekantery) alebo vysokootáčkové centrifúgy, ktoré rýchlym otáčaním rozdružia baktérie od zvyšku média.
Mikrofiltrácia – cez membrány s veľkosťou pórov ~0,1–0,2 µm v režime cross-flow alebo backflush, kde sa baktérie zachytávajú na povrchu membrány a pravidelným spätným prúdením sa membrána čistí.
Ultrafiltrácia – membrány s menšími pórami pre simultánne zachytenie baktérií a nízkomolekulových látok, opäť v cross-flow režime.
- Kvasinky
Kvasinky majú rozmery medzi baktériami a vláknitým mycéliom a často tvoria jednotlivé bunky alebo menšie klastre, preto využívame kombináciu metód:
Odstreďovanie – diskové separátory alebo dekantéry, podobne ako pri baktériách, ale pri nižších otáčkach kvôli väčšej veľkosti buniek.
Usadzovanie – v špeciálnych sedimentačných nádržiach, kde sa kvasinkové bunky pomaly ukladajú na dne pod vplyvom gravitácie, často za pomoci flokulantov (napr. polyalylylamín).
Flotácia – aeróbne či chemické flotujúce činidlá pri malom prietoku plynu alebo vzduchu privádzaného do média, ktoré zachytávajú kvasinky na bublinách a vynášajú ich na povrch, odkiaľ sa dajú mechanicky odstrániť.
Vo všetkých prípadoch platí, že voľba konkrétnej technológie závisí od požadovanej čistoty produktu, viskozity média, veľkosti a tvaru biomasy, ako aj ekonomických a prevádzkových kritérií.
2 hlavné rozdiely medzzi membránovými a cytosolovými dehydrogenázami.
Lokalizácia a dráha prenosu elektrónov
Cytosolové dehydrogenázy pôsobia vo voľnom cytosole a pri reakcii odoberajú elektróny z substrátu pomocou voľných koenzýmov NAD⁺ alebo NADP⁺, ktoré sa potom vo voľnej forme difúzne vracajú do metabolizmu (napr. glykolýza, pentózový cyklus) na opätovnú oxidáciu či redukciu .
Membránové dehydrogenázy sú viazané v cytoplazmatickej membráne a elektróny z ich substrátu neputujú cez voľné NAD(P)H, ale priamo vstupujú do bunkového dýchacieho reťazca (respiračného reťazca), kde sa používajú na generáciu protonového gradientu a ATP. Koenzým FAD je tu zvyčajne viazaný, neodchádza do cytosolu .
Reverzibilita a špecificita koenzýmov
Cytosolové dehydrogenázy sú často vratné enzýmy s vysokou afinitou k voľným NAD⁺ alebo NADP⁺, čo im umožňuje pracovať v oboch smeroch podľa pomeru NADH/NAD⁺ alebo NADPH/NADP⁺ v bunke. Vďaka tomu sa dá pomerne jednoducho recyklovať NAD(P) v cytosolických dráhach (napr. regenerácia NAD⁺ oxidáciou laktátu či regenerácia NADPH vo forme redukcie 6-fosfoglukonátu)
Membránové dehydrogenázy sú spravidla nevratné a špecializované na konkrétnu reakciu (napr. alkoholdehydrogenáza v Acetobacter či glukózadehydrogenáza v Gluconobacter), pričom koenzým FAD je pevne viazaný v aktívnom mieste (“prosthetic group”) a recykluje sa len vnútorným presunom elektrónov do dýchacieho reťazca, nie spätnou difúziou koenzýmu
Možnosť recyklácie NAD(P) a FAD.
NAD(P)H/NAD(P)⁺ v cytosole sa recykluje prostredníctvom metabolických okruhov (glykolýza, pentózový cyklus, laktátdehydrogenáza, glutamátdehydrogenáza a i.), prípadne umelých enzýmových systémov (formiátdehydrogenáza, alkoholdehydrogenáza) na udržanie pomeru NAD(P)H/NAD(P)⁺.
FAD/FADH₂ viazané v membránových dehydrogenázach sa recykluje bez opustenia enzýmu – elektróny z FADH₂ sa predávajú priamo do transportného reťazca (napr. ubichinónu), čím sa FAD regeneruje na FAD a je pripravený na ďalšiu katalýzu.
Prečo možno kyselinu glukónovú pomocou A. Niger produkovať bez potreby metabolickej energie? Prečo jej soli neinhibujú produkciu?
Produkcia kyseliny glukónovej Aspergillus niger prebieha vďaka dvom extracelulárnym enzýmom – glukózaoxidáze (GOD) a kataláze (KAT) – ktoré fungujú ako čistý oxidatívny katalyzátor, nezávislý od bunkového energetického metabolizmu:
Žiadna spotreba ATP ani inej metabolickej energie
Glukózaoxidáza na povrchu mycélia oxiduje β-D-glukózu priamo na D-glukono-δ-lakton s využitím molekulárneho kyslíka ako akceptora elektrónov (FAD↔FADH₂), pričom nevzniká žiadna potreba regenerovať ATP či NAD(P)H v bunke. Produkty (lakton a H₂O₂) sa ďalej spracujú mimo bunky – kataláza rozkladá H₂O₂ na O₂ a H₂O a lakton sa spontánne (alebo enzymaticky) hydrolyzuje na kyselinu glukónovú. Preto není potrebná životaschopnosť mycélia, stačí prítomnosť týchto dvoch enzýmov .
Soly kyseliny glukónovej neinhibujú enzýmový systém
Produkcia prebieha pri pH 5,0–6,5, pričom aj vysoké koncentrácie glukonátu (300–600 g/l) nijako neomezujú aktivitu GOD/KAT. Soli (glukonáty) sú vo vodnom roztoku dobre rozpustné a nevytvárajú spätoväzbné inhibície na glukózaoxidázu. Enzým si udržuje vysokú špecificitu a aktivitu až do poklesu pH pod približne 4,0, kedy sa začína znižovať jeho špecifická aktivita .
Vďaka tomuto mechanizmu možno kyselinu glukónovú vyrábať efektívne, s minimálnym energetickým vstupom bunky a bez potreby neustálej regenerácie metabolických kofaktorov.
Čo je riedina a prečo má zloženie aké má?
V technológii výroby octu sa pojem riedina (substrát) vzťahuje na kvapalný roztok, ktorý sa kontinuálne alebo obdobne privádza do fermentačného lôžka (bukových hobliniek) či submerzného reaktora a v ktorom Acetobacter oxiduje etanol na kyselinu octovú.
– Definícia: Riedina je vlastne pripravený roztok etanolu a už vzniknutej kyseliny octovej, niekedy doplnený o živiny (napr. glukózu, amónne soli, stopové prvky), ktorý sa v procese „rýchleho octárenia“ privádza zvonka do octárenského lôžka ako kontinuálny prítok a zároveň slúži na odvádzanie tepla vznikajúceho pri exergónnej oxidácii .
– Typické zloženie
Letná riedina: 2,5 % objemových etanolu + 8,5 % hmotnostných kyseliny octovej
Zimná riedina: 3,0 % objemových etanolu + 8,0 % hmotnostných kyseliny octovej
Zmeny koncentrácie etanolu a octu vyplývajú z rozdielnej účinnosti ochladzovania („chladenie riedinou“) v letnom a zimnom období – vyššia teplota znižuje rozpustnosť kyslíka a zhoršuje odvod tepla, preto sa zvyšuje podiel etanolu, aby sa pri rovnakom termickom zateplení zachovala požadovaná rýchlosť oxidácie
.
– Prečo práve takéto zloženie?
Optimalizácia oxidačnej kinetiky
– Príliš nízky obsah etanolu spomalí produkciu octu, príliš vysoký inhibuje Acetobacter a zvyšuje riziko toxickej akumulácie acetaldehydu. Cielené 2,5–3 % obj. etanolu udržiava biokatalytickú aktivitu blízko maximálneho výkonu.
Kontrola pH a spätnoväzbného inhibičného efektu
– Už vzniknutá kyselina octová vo výške 8–8,5 % zaisťuje, že pH riediny zostáva dostatočne nízke na potlačenie kontaminácie nežiaducimi mikróbmi a zároveň ostáva pod inhibičnou hladinou pre producentov octu.
Tepelná bilancia a masový prenos kyslíka
– Oxidácia etanolu je silne exergónna, a preto sa musí efektívne odvádzať vzniknuté teplo. Riedina prechádzajúca cez lôžko hobliniek zabezpečuje chladiaci efekt a udržiava stabilnú teplotu v rámci optimálneho pásma (zvyčajne 28–32 °C)
Vzhľadom na tieto faktory má riedina „vychytané“ pomery etanolu a octu – vyváženie medzi vysokou produktivitou, bezpečím prevádzky a ochranou kvality finálneho octu.
5 faktorov ktoré ovplyvňujú výber suroviny
Pri výbere suroviny pre biotechnologický proces sa zvyčajne zohľadňuje päť kľúčových faktorov:
Dostupnosť a cena
Surovina musí byť komerčne dostupná v dostatočnom množstve a za prijateľnú cenu, aby výrobný proces zostal ekonomicky rentabilný.
Chemické zloženie a čistota
Obsah cieľového substrátu (napr. sacharidov, tukov či aminokyselín) a prítomnosť nežiaducich inhibítorov či toxínov zásadne ovplyvnia výťažok aj kvalitu produktu.
Stabilita a sezónnosť dodávok
Konzistentný prísun suroviny počas celého roka je nevyhnutný najmä pri kontinuálnych procesoch; sezónne prebytky či deficity môžu vyžadovať skladovanie či alternatívne zdroje.
Kompatibilita s downstream spracovaním
Suroviny s vysokým podielom recalcitrantných látok (napr. lignín v rastlinných vedľajších produktoch) môžu skomplikovať purifikáciu a zvýšiť nároky na úpravu média.
Environmentálna a regulačná záťaž
Pôvod suroviny (obnoviteľné vs. fosílne zdroje), uhlíková stopa a legislatívne obmedzenia (GMO vs. non-GMO, potravinárske či farmaceutické normy) ovplyvňujú výber z hľadiska udržateľnosti i schválenia finálneho produktu.
Produkcia (fermentačne) butanolu. 2 príklady + izolácia.
- Acetón-butanolová fermentácia s Clostridium acetobutylicum
Toto je klasický ABE-proces (Acetone-Butanol-Ethanol), pri ktorom striktné anaeróbne baktérie Clostridium acetobutylicum z škrobnatých alebo sacharidických substrátov (obilie, zemiaky, melasa, glukóza, fruktóza, xylóza…) vyrábajú v prvej fáze mastné kyseliny (maslovú, octovú), potom prechádzajú do fázy solventogenézy, kedy syntetizujú hlavne butanol (~60 %), acetón (~30 %) a malé množstvo etanolu (< 10 %) .
Podmienky fermentácie
Striktne anaeróbne prostredie (N₂, CO₂), teplota 35 – 38 °C, pH 4,7 – 8,0 (optimálne 5,0 – 6,8).
Limitácia dusíka a fosforu stimuluje prechod do solventogenézy.
Prítomnosť iónov: Cu²⁺ už 2 ppm inhibuje (5 ppm zastavuje) produkciu, Fe²⁺ ju naopak podporuje (~+7–10 % butanolu).
Aktivátory: biotín, kyselina p-aminobenzoová, kvasničný autolyzát .
Izolácia produktu
Po fermentácii sa zmes butanol : acetón : etanol destiluje vo viackolónovom systéme, kde sa najprv oddelí butanol (najťažšia zložka), potom acetón a nakoniec etanol. Výťažnosť hlavných rozpúšťadiel sa pohybuje okolo 33 – 40 % .
- Dvojstupňová fermentácia kyselín a následná solventogenéza
V modernejších režimoch sa fermentácia rozdeľuje na dve nezávislé kultivácie:
Acidogénna fáza s Clostridium tyrobutyricum (alebo Clostridium butyricum), pri ktorej sa tvorí kyselina maslová a octová zo sacharidov.
Solventogénna fáza s Clostridium acetobutylicum, ktoré tieto kyseliny konvertuje na butanol, acetón a etanol .
Tento prístup umožňuje vyššie celkové výťažky butanolu vďaka oddeleniu kyselinotvornej a solventotvornej fázy, lepšej kontrole pH a redoxného stavu buniek.
Izolácia prebieha rovnako destilačne, často však kontinuálnym spôsobom s extrakciou rozpúšťadiel (napr. organickým rozpúšťadlom v tretej fáze reaktora), strippingom párou či vákuovou destiláciou na okamžité odstraňovanie toxického butanolu priamo počas fermentácie
Prírodné sladidlá (okrem klasických cukrov)
Steviol glycosidy
Pôvod: extrahujú sa z listov juhoamerickej rastliny Stevia rebaudiana (Asteraceae).
Hlavné zložky: steviosid, rebaudiosid A, rebaudiosid C.
Mogrosidy
Pôvod: získavajú sa z plodov mníchovskej hrušky (Siraitia grosvenorii, známej aj ako Luo Han Guo).
Kľúčový komponent: mogrosid V, ktorý je až ~250× sladší ako sacharóza.
Glycyrrhizín
Pôvod: izoluje sa z koreňov sladkého drievka (Glycyrrhiza glabra).
Vlastnosť: približne 30–50× sladší ako cukor, s charakteristickou dochuťou.
Thaumatin
Pôvod: vysoko sladký proteín extrahovaný z plodov tropickej rastliny Thaumatococcus daniellii.
Sladivosť: 1 600–3 000× silnejšia než sacharóza na hmotnosť.
Monellin
Pôvod: sladký proteín izolovaný z bobúľ africkej rastliny Dioscoreophyllum cumminsii (Ceylon berry).
Sladivosť: približne 1 400× voči sacharóze.
Brazzeín
Pôvod: proteín získaný z plodov drobného kríčka Pentadiplandra brazzeana (západoafrická “serendipity berry”).
Sladivosť: ~500–2 000× silnejší než cukor.
Neoculin
Pôvod: glycoproteín izolovaný z plodov Curculigo latifolia (východoázijská rastlina), okrem sladkosti tiež mení kyslé chute na sladké.
