Reacción en cadena de la polimerasa Flashcards
(33 cards)
Qué es una PCR?
Es un método de amplificación de una secuencia específica del ADN
El método de la PCR emplea tres componentes, ¿Cuáles son?
- Enzima ADN polimerasa termoestable.
- Grandes cantidades de desoxinucleótidos trifosfato
- dos cebadores de cadena sencilla de secuencias conocidas completarias al segmento ADN diana.
Cuándo sabremos que se trata de una PCR convencional o de una RT-PCR?
PCR, convencional utilizará ADN genómico
RT-PCR, utilizará ADN complementario proveniente del ARNm.
Qué enzima controla la RT-PCR?
Transcriptasa reversa
Cuáles son los tres pasos de la PCR?
- Desnaturalización inicial
- Hibridación
- Extensión
¿Por qué es importante la desnaturalización inicial en el proceso de PCR?
Porque se inactivan las proteasas y nucleasas y se eliminan algunas sustancias volátiles utilizadas en la purificación del ADN.
En el proceso de desnaturalización inicial, ¿Cuánto es la temperatura y tiempo que se debe someter al tubo que contiene la mezcla?
- 92-96°C /3 a 10 minutos.
Ciclos de PCR, ¿cuántos veces en promedio se repiten los procesos de desnaturalización, hibridación y extensión de la secuencia de ADN?
20-40 ciclos
Cuáles son las tres etapas principales en los ciclos de PCR?
- Desnaturalización
- hibridación
- Extensión o elongación
De qué depende que el tiempo promedio de desnaturalización que es de 20-30 segundos, con temperatura 94-95 °c aumente o disminuya?
Depende de la cantidad de C-G que hay en la secuencia del ADN blanco, ya que este le dará mayor resistencia por su triple enlace.
Qué ocurre en el proceso de desnaturalización?
Las hebras de ADN se separan, por ruptura de los puentes de hidrógeno
Qué ocurre en el proceso de hibridación?
Los primers o cebadores se alinean al extremo 3’ de la hebra molde y se hibrida con su secuencia complementaria
Qué es la temperatura de annealing?
La temperatura de annealing es la temperatura de hibridación que es cuando un primer se une a la extremo correspondiente del ADN diana.
Cuánto suele ser la temperatura/tiempo de annealing óptima?
entre 55-60°C durante 20 a 40 segundos.
Qué sucede si la temperatura de annealing y el diseño de los primers son incorrectos?
LA estabilidad y especificidad del complejo será ineficiente.
Qué enzima se une al complejo hebra molde-primer?
Taqpolimerasa.
En qué dirección la TAQpolimerasa agrega nucleótidos complementarios para crear cadenas completas de ADN?
5’ 3’
Cuáles son las temperaturas óptimas de extensión?
75°c y 80°C (ideal =72°C)
por qué la temperatura de 72 grados es la ideal para el proceso de extensión de la cadena de ADN?
ya que en esta temperatura la enzima taqpolimerasa es funcional.
En qué momento ocurre la amplificación final?
Después del último ciclo de PCR.
Cuánto es la temperatura y tiempo de la amplificación final?
72°C por 10 minutos
Cuál es el objetivo de la amplificación final?
Permitir que los productos de amplificación parciales terminen de completarse.
A cuánta temperatura puede ser almacenada las muestras post- amplificación final?
Las muestras pueden ser almacenadas a -20°C hasta su posterior análisis.
Cuáles son los tres factores relacionados con los iniciadores que influyen en la temperatura e hibridación?
- la concentración
- Números de bases
- porcentaje de guanina y citosina.
