Replicazione del DNA Flashcards
Modelli di replicazione
I due ricercatori (Watson e Crick) proposero inoltre che il DNA si duplicasse secondo un modello di replicazione semiconservativa, ossia che la doppia elica si separasse nei due filamenti e che ognuno di essi servisse da stampo per la sintesi di un nuovo filamento complementare. Come risultato, le due molecole di DNA a doppia elica ottenute al termine della replicazione avrebbero dovuto essere composte da un filamento “originale” e da un filamento di nuova sintesi. Altri due modelli di replicazione erano però possibili: la replicazione conservativa, in cui la doppia elica parentale funge da stampo per la sintesi di una nuova doppia elica, senza contribuirvi; la replicazione dispersiva, in cui frammenti della molecola parentale di DNA servono da stampo per l’assemblaggio, forse casuale, di due nuove molecole, ciascuna contenente alcune porzioni vecchie e alcune porzioni nuove. Si dovette aspettare solo pochi anni per avere conferma sperimentale dell’intuizione di Watson e Crick visto che nel 1958, grazie a un esperimento si raccolsero le prove dell’effettiva replicazione semiconservativa del DNA.
Ori e forcella di replicazione
Il punto specifico in cui ha inizio lo svolgimento della doppia elica prende il nome di origine di replicazione (ori). Nella maggior parte dei casi, la replicazione del DNA procede in maniera bidirezionale a partire dall’origine di replicazione: si formano così due forcelle di replicazione, per ogni origine, che si muovono allontanandosi dall’origine in direzioni opposte. Le forcelle viaggiano rapidissime; negli eucarioti però la velocità di replicazione è minore – rispetto ai procarioti – probabilmente a causa dell’impacchettamento del DNA eucariotico in cromatina. Nelle immagini di microscopia elettronica, le forcelle di replicazione appaiono come strutture simili a una Y dove le due braccia corte rappresentano la forcella aperta con il DNA in fase di duplicazione, mentre la gamba della lettera Y raffigura la doppia elica del DNA da copiare e non ancora svolta. Una volta che le proteine iniziatrici si sono legate all’origine di replicazione, il DNA a doppio filamento si svolge a livello dell’origine, producendo stampi a singolo filamento per la sintesi di nuovo DNA. Si forma così una “bolla” di replicazione, che di solito ha una forcella di replicazione a ogni estremità.
Possedendo in genere un DNA circolare e di dimensioni più ridotte, i procarioti hanno di solito una singola origine di replicazione, così che le due forcelle di replicazione procedono lungo il “cromosoma” circolare in entrambe le direzioni e si incontrano dalla parte opposta. Diversamente, le molecole di DNA lineare che costituiscono i cromosomi eucariotici, che sono tipicamente molto più lunghi di quelli procariotici, hanno molteplici origini di replicazione, da cui si generano altrettante unità di replicazione, dette repliconi.
DNA elicasi
Al centro di ogni replicone c’è un’origine di replicazione, da cui inizia la sintesi del DNA in entrambe le direzioni, mediante il coinvolgimento di diversi enzimi. L’enzima DNA elicasi espone una regione di DNA a singolo filamento, che deve rimanere tale affinché la replicazione possa procedere. Per evitare che le basi tornino ad accoppiarsi, spontaneamente (per complementarità), quando la separazione della doppia elica è iniziata, ai filamenti singoli esposti si attaccano rapidamente proteine che legano il filamento singolo (SSBP, Single-Strand Binding Proteins), che hanno il ruolo di stabilizzare il DNA svolto (cioè, denaturato), mantenendolo in una conformazione distesa a singolo filamento, in modo che sia accessibile al macchinario della replicazione.
DNA polimerasi
La polimerizzazione delle catene nucleotidiche complementari ai filamenti parentali avviene grazie all’azione di un enzima, chiamato DNA polimerasi, che assembla le singole componenti monomeriche, sintetizzando per complementarità di base uno dei due filamenti della molecola di DNA usando il filamento originale come stampo. Le DNA polimerasi non possono iniziare la sintesi di un nuovo filamento in assenza di un innesco; per risolvere questo problema esiste un enzima, chiamato primasi, il quale sintetizza, a livello dell’origine di replicazione e senza bisogno di innesco, un breve tratto di RNA chiamato innesco (o primer).
Direzionalità allungamento
L’allungamento del filamento avviene all’estremità 3’ del filamento di DNA, cioè, la catena cresce in direzione 5’3’. Il meccanismo di polimerizzazione 5’3’ pone un problema a livello della forcella di replicazione. Infatti, dato che la DNA polimerasi sintetizza il DNA solo in direzione 5’3’, il filamento stampo deve essere “letto” in direzione 3’5’. Tuttavia, i due filamenti di DNA sono appaiati tra loro in direzioni opposte, cioè sono antiparalleli; di conseguenza, in corrispondenza di ogni forcella di replicazione un filamento viene sintetizzato su uno stampo che va da 3’ a 5’ (direzione di lettura corretta per la DNA polimerasi), mentre l’altro filamento si forma su uno stampo che va nel verso opposto, da 5’ a 3’ (direzione di lettura opposta a quella utilizzabile dalla DNA polimerasi). I due filamenti figli sono distinti in base al tipo di crescita: uno dei nuovi filamenti, definito filamento guida, o anticipato, è sintetizzato in modo continuo dato che cresce nella direzione 5’3’, mentre l’altro filamento di nuova sintesi, definito filamento ritardato, o in ritardo, dovendo crescere in direzione 3’5’, è formato da brevi frammenti discontinui di DNA, che sono sintetizzati in direzione opposta rispetto al movimento della forcella replicativa, cioè la DNA polimerasi si muove all’indietro rispetto alla forcella, sempre in direzione 5’3’. Tali corti frammenti di DNA di nuova sintesi, detti frammenti di Okazaki, sono poi man mano legati tra loro dalla DNA ligasi, formando un nuovo filamento integro di DNA.
Controllo e riparazione DNA
- La correzione di bozze è una caratteristica attività di controllo (di autocorrezione) delle DNA polimerasi replicative che, una volta catalizzata l’aggiunta di un nuovo nucleotide, posseggono la capacità di controllare se l’appaiamento è ottimale, basandosi sulla stabilizzazione, o meno, dei legami idrogeno tra le basi appaiate. Così la DNA polimerasi, sfruttando la sua attività esonucleasica in grado di idrolizzare il DNA nell’orientamento 3’5’, rimuove il nucleotide errato rompendo il legame fosfodiesterico, lo sostituisce con quello corretto ed effettua nuovamente il controllo. L’attività autocorrettiva è contemporanea alla sintesi: prima di aggiungere il nucleotide successivo alla catena, l’enzima controlla se quello precedente si è appaiato correttamente al filamento stampo.
- Un ulteriore sistema di controllo del corretto appaiamento tra le basi è rappresentato dal sistema di riparazione dei disappaiamenti, o riparazione di appaiamenti scorretti, ossia la capacità di riconoscere su un doppio filamento neosintetizzato l’eventuale appaiamento errato tra due basi non complementari.
- Un altro meccanismo di riparazione del DNA è il meccanismo di riparazione per escissione, che rimuove e sostituisce le basi anomale.
