Replikacija DNA

Question 1

Ukratko opisi pokuse koju su dokazali da je DNA nositelj nasljedne informacije

Answer 1

Pokus s misevima - transformacija avirulentnih pneumokoka -> kad su se pomijesali nevirulentni pneumokoki i mrtvi virulentni pneumokoki nastaju su pneumokoki koji su ubili miseve -> nesto u mrtvom uzorku je prenijelo informaciju na zivi nevirulentni uzorak -> DNA

Pokusi s izotopno obiljezenim bakteriofagom T2 -> ili proteini ili DNA prenosi informaciju -> nakon sto bakteriofag odradi svoje, obiljezena DNA “prezivljava” i prenosi nasljednu informaciju, a proteini u ljusci nisu videni jer su otisli nakon ubrizganja DNA u stanicu

Question 2

Sto znaci da je replikacija DNA semikonzervativna?

Answer 2

To znaci da je “pola” (jedan lanac) molekule DNA prisutno u novoj dvolancanoj DNA -> originalna DNA se dijeli na dva lanca kalupa koji zavrse u novosintetiziranim lancima DNA

Question 3

Opisi Meselsonov i Stahlov eksperiment i zasto je vazan?

Answer 3

Taj eksperiment je dokazao semikonzervativnost replikacije DNA

Zapoceli su s teskom DNA - DNA koja sadrzi samo 15N koju su onda dali da se reproducira na podlozi sa obicnim laksim 14N

Nakon prve diobe nastali su lanci DNA koji su pola 15N pola 14N, a sa svakom daljnom diobom se kolicina lakse DNA povecavala zato sto su samo 2 lanca (od svih koji su nastali dosad) zapravo 15N -> to se vidi kao rezultat nakon centrifugiranja dobivenih uzoraka (15N je tezi pa ce se vise pomaknuti od 14 N)

Question 4

U kojim smjerovima se cita DNA kalup, a u kojem smjeru sintetizira novi lanac?

Answer 4

DNA lanac se UVIJEK sintetizira od 5-3, a s obzirom da je lanac kalup komplementaran i antiparalelan, on se mora citati u 3-5 smjeru

Question 5

Objasni mehanizam katalize DNA polimeraza

Answer 5

DNA polimeraza u svojem aktivnom mjestu sadrzi dva aspartata i dva magnezijeva iona

Aspartati koordiniraju magnezijeve ione, a jedan magnezijev ion (gornji) aktivira kisik koji ce napasti dNTP (supstrat) koji ce se ugraditi u novonastali lanac i pozicionira alfa fosfatnu skupinu dNTPa, drugi magnezij (donji) je koordiniran sa sve tri fosfatne skupine dolazeceg dNTP-a

Kisik iz hidroksilne skupine s 3 kraja novonastalog lanca napada alfa fosfatnu skupinu dNTP-a koje otpusta beta i gama fosfatne u obliku pirofosfata te tako dolazi do ugradnje novih nukleotida

Question 6

Koja su obiljezja DNA polimeraze?

Answer 6

Potreban im je kalup - DNA se sintetizira prema komplementarnom lancu

Treba im klica (pocetnica) - kratki lanac RNA sa slobodnim OH na 3-kraju

Imaju razlicite brzine replikacije i stupnje procesivnosti

Velika tocnost replikacije - 10^4-10^5

Proofreading aktivnost - egzonukleazna aktivnost (najcesce 3-5 smjer) kojom povecavaju tocnost replikacije na 10^6-10^8

Question 7

Kako se osigurava tocnost replikacije kod DNA polimeraza?

Answer 7

1. prostorna komplementarnost baze predloska i dolazeceg dNTP-a -> ne mogu doci krivo sparene baze zbog oblika aktivnost mjesta enzima
2. ako su baze dobro sparene, uvijek moraju biti prisutna dva donora vodikove veze sa strane malog utora DNA (jedan akceptor za svaku bazu) -> veze stvaraju konzervirani Arg i Gln iz aktivnog mjesta -> ako nema tih vodikovih veza, dNTP nece bit “prihvacen”

Question 8

Je li potrebno stvaranje vodikovih veza medu supstratom i predloskom tijekom reakcije DNA polimeraze?

Answer 8

Ne, jer ne postoji provjera za nastajanje vodikovih veza, samo je potreban odgovarajuc oblik i dobro pozicioniran akceptor vodikove veze (konzervirani Arg i Gln)

Question 9

Kako radi proofreading aktivnost DNA polimeraza?

Answer 9

To je hidroliticka 3-5 egzonukleazna aktivnost -> ako dode do greske pri replikaciji taj krivo dodani nukleotid nije toliko stabilan i moze se pomaknuti prema egzonukleaznog aktivnog mjesta (a cijeli enzim se mice nukleotid unazad) gdje ce se odcijepiti te ce se nakon toga ubaciti tocan nukleotid

Question 10

Po cemu je posebna DNA polimeraza I?

Answer 10

Jer uz 3-5 egzonukleaznu aktivnost posjeduje i 5-3 egzonukleaznu aktivnost -> moze cijepati nukleotide “ispred sebe”, tj cijepati nezeljene nukleotide a onda odmah sintetizirati tocne nukleotide nakon popravka

Vazna za sintezu tromog lanca -> micanje RNA klice i sinteza DNA lanca te za popravak DNA ostecenja -> NER (nucleotide excision repair) (popravak ostecenja izrezivanjem nukleotida) - sintetizira tocan nukleotidni slijed nakon sto je uvrABC ekscinukleaza izrezala segment nukleotida koji sadrzi ostecenja koja uzrokuju veliku deformaciju dvostruke zavojnice

Question 11

Sto su replikacijske raslje?

Answer 11

Oblik koji nastaje tijekom replikacije DNA -> lanci se odvajaju u oba smjera -> dokazuje da je replikacija DNA bidirekcijska, tj. da ide i lijevo i desno od smjera vezanja

Question 12

Objasni razliku izmedu tromog i vodeceg lanca

Answer 12

Vodeci lanac je onaj na kojem se DNA replicira normalno -> po njemu polimeraza ide u 3-5 smjeru i lanac se sintetizira u 5-3 smjeru bez komplikacija

Tromi lanac je komplementaran vodecem -> problem jer ako se DNA kalup za vodeci cita u 3-5 smjeru onda se kalup za tromi lanac ne moze citat u tom smjeru (jedino je dozvoljen 3-5 smjer) -> rjesenje je da se “otvaranjem” DNA stvori novi dio tromog lanca koji ce se kasnije spojiti u cjeloviti tromi lanac (okazakijevi fragmenti)

Question 13

Opisi gradu DNA polimeraze III

Answer 13

Srz Pol III - sadrzi alfa, epsilon i omega podjedinice -> one imaju polimeraznu i egzonukleaznu aktivnost

Beta pomicne hvataljke -> “drze” lance DNA povezane s DNA polimerazom

tau podjedinica - povezuje Pol III srz i nosac hvataljki

Nosac hvataljki - delta, gama i tau podjedinice -> prenose nove hvataljke na lanac DNA

Question 14

Koji su jos enzimi potrebni za replikaciju DNA?

Answer 14

Helikaza - razdvaja lance DNA jedan od drugog

SSB - singlestrandbinding protein -> stabilizraju jednolancane DNA

Topoizomeraza II - DNA giraza -> upumpava negativne superzavoje ispred replikacijskih raslji -> potrebno zbog topoloskog stresa induciran helikaznom aktivnoscu

Question 15

Objasni replikaciju vodeceg lanca

Answer 15

Zapocinje na klici te se vodeci lanac sintetizira koliko procesivnost polimeraze dozvoljava -> s obzirom da se lanac cita u 3-5 smjeru, a cijelo vrijeme se “otvara” 5-kraj DNA kalupa, vodeci lanac nastaje kako helikaza otvara DNA kalup

Question 16

Objasni replikaciju tromog lanca DNA

Answer 16

Taj proces je opisan modelom trombona

Tromi lanac se sintetizira u obliku okazakijevih fragmenata koji se kasnije spajaju te nastaje cjeloviti tromi lanac

Svaki okazakijev fragment pocinje na svojoj klici koju stvara primaza

Svaki okazakijev fragment se replicira toliko dugo dok ne dode do klice prethodnog okazakijevog fragmenta -> tijekom te sinteze se “omca “ produljuje kako se i produljuje novonastali okazakijev fragment (slicno kako se mice trombon) -> kada okazakijev fragment udari u prosli fragment, njegova sinteza je gotova i ta hvataljka se otpusta, a nositelj hvataljki veze novu hvataljku na novosintetiziranu klicu te se ona veze na kataliticku srz Pol III te dolazi do pocetka sinteze novog okazakijevog fragmenta, a omca se smanji (opet slicno kako se mice trombon)

Nakon sto su svi okazakijevi fragmenti sintetizirani, DNA polimeraza I sjeda na DNA kalup te 5-3 egzonukleaznom aktivnoscu cijepa RNA klice, a onda dolazi DNA ligaza koja konacno spaja kraj pocetak i kraj dva okazakijeva fragmenta

Question 17

Objasni inicijaciju replikacije DNA u E. Coli

Answer 17

Replikacija zapocinje na tocno odredenom, jednom mjestu -> oriC

na oriC se veze DnaA koji otvara DUE (DNA unwinding element), a onda Dna b helikaza potpomognuta DnaC se veze na razdvojene lance u DUE -> te DnaB helikaze onda odvajaju molekulu DNA u oba smjera -> nastaju replikacijske raslje

Question 18

Opisi inicijaciju replikacije DNA kod eukariota

Answer 18

Puno slozenija nego kod bakterija -> treba biti uskladena sa stanicnim ciklusom

Ima puno vise mjesta ishodista replikacije -> jer je eukariotski genom puno puno veci i puno se sporije replicira nego prokariotski i treba se stic sve replicirat u vremenu stanicnog ciklusa

Ima razlicitih DNA polimeraza -> glavne su DNA polimeraza delta i epsilon

Question 19

Objasni Sangerovu dideoksi metodu sekvenciranje DNA

Answer 19

Sekvenciranje DNA - odredivanje nukleotidnog slijeda DNA

Sangerova metoda sekvenciranja se bazira na replikaciji DNA, ali uz prisustvo dideoksi nukleotida koji prekidaju replikaciju kada se vezu na lanac DNA

Koristi se jako malo dideksi analoga nukleotida -> tako da se ne ugradi na svaku prvu mogucnost ugradnje tog nukleotida (da mogu nastajat duzi fragmenti), ali svejedno dovolnjno da imamo ugradeni dideoksi analog svaki put tamo gdje bi se trebao ugraditi obicni nukleotid

Pripreme se 4 reakcijske smjese -> svaka ima obiljezene obicne nukleotide, a onda svaka zasebno ima jedan dideoksi analog nukleotida

Ugradnjom dideoksi analoga nukleotida umjesto deoksi nukleotida dolazi do terminacije replikacije i nastaje fragment odredene velicine -> svaka smjesa sadrzi fragmente DNA koji su dugi onoliko nukleotida koliki je redni broj nukleotida ciji smo dideoksi nukleotid ubacili -> npr. ako u smjesi gdje smo ubacili ddATP imamo fragmente od 4,6 i 9 nukleotida, to znaci da se Adenilat trebao ugraditi na mjesta 4,6 i 9 jer se zapravo tamo ugradio ddATP i prestao replikaciju -> znamo da nam je u komplementarnom lancu od naseg analiziranog adenilat na mjestima 4,6 i 9

Pomocu elektroforeze dobivene 4 smjese mozemo razluciti fragmente koji se razlikuju samo po jednom fragmentu -> citajuci elektroforetogram od dolje prema gore dobivamo 5-3 slijed komplementarnog lanca od lanca kojeg smo analizirali

Question 20

Koje su moguce vrste ostecenja DNA?

Answer 20

Oksidacija, hidroliza i metilacija

DNA se isto moze ostetiti interkalirajucim molekulama (klormetin, ciklofosfami ili cisplatin) koji narusavaju stacking interakcije tj strukturu DNA

Question 21

Sto nastaje hidrolizom amino skupine citozina?

Answer 21

Uracil

Zato je i vazno da se uracil ne nalazi u DNA -> kada bi bio u DNA ne bi mogli raspoznati da li je uracil tu samo jer je ili je prisutan zbog ostecenja citozina

Question 22

Koje su najcesce posljedice ostecenja DNA

Answer 22

Ili nastajanje nezeljenih parova baza ili nastajanje npr timinskih dimera koji narusavaju strukturu dvostruke zavojnice DNA

Question 23

Objasni Ames test

Answer 23

Ames test je test na mutagenost molekula

Bakterije modificirane tako da im fali enzim koji stvara histidin (esencijalna aminokiselina) su postavljene na podlogu bez histidina -> bez ikakvog dodatka mutagene molekule prezivljava samo jako malo bakterije koje su uspjele mutirati tako da ipak mogu napraviti enzim za biosintezu histidina

Dodavanjem mutagene molekule mozemo vidjeti koliko bakterija prezivljava (jer mutagene molekule povecavaju sansu da bakteriju mutiraju tako da ipak nastaje enzim za biosintezu histidina), ali se gleda i kolicina bakterija koja odumire zbog letalne kolicine mutacija zbog prisutnosti mutagene molekule

Question 24

Objasni princip mismatch repair-a

Answer 24

Prisutan je kod E.Coli -> uz pomoc metilacije DNA koju radi Dam metilaza

Dam metilaza metilira Adenilat na C6 -> jako kratko nakon replikacije novonastali lanac nije metiliran, ali originalni je

Tijekom tog vremena se MutS i MutL vezu na krivo spareni par baza i “krecu” se po lancu DNA dok ne nadu metilirani adenilat -> metilirani adenilat pokazuje koji lanac je originalan, a koji je novonastali (tj koji lanac se treba pocijepati jer je krivo repliciran)

Zatim dolazi endonukleaza MutH koja zarezuje nemetilirani lanac tamo gdje je baza komplementarna metiliranom adenilatu

Zatim dolazi egzonukleaza koja makne cijeli dio novosintetiziranog lanca od krivo sparene baze donastalog procijepa te onda dolazi DNA Pol III koja cijeli taj izrezirani dio opet replicira, ali ovaj put tocno uz pomoc SSBa

Question 25

Objasni NER - popravak DNA izrezivanjem nukleotida

Answer 25

Sluzi popravku ostecenja koja uzroukuju velike deformacije dvostruke zavojnice - npr nakon stvaranja timinskih dimera

uvrABC ekscinukleaza izrezuje 12 nukleotida oko ostecenih nukleotida, a DNA helikaza odvaja odrezane nukleotide s lanca DNA -> DNA polimeraza I dolazi i opet sintetizira odrezani dio komplementarnog lanca -> dolazi DNA ligaza koja spaja novosintetizirani popravljeni nukleotidni lanac i originalni lanac

Question 26

Objasni base excision repair - BER

Answer 26

Sluzi popravku cestih ostecenja poput krivo sparenih baza
Npr. popravak ostecenja DNA uslijed deaminacije citozina ili adenina

Prvo dolazi DNA glikozidaza (svaka baza ima svoju DNA glikozidazu)

Zatim dolazi AP endonukleaza koja prepoznaje abazicno mjesto te tjera pucanje fosfodiesterske veze , a zatim dolazi DNA polimeraza I koja zajedno s DNA ligazom ubacuje tocan nukleotid i povezuje nukleotide

Question 27

Objasni DNA fotolijazu

Answer 27

Ona se koristi za cijepanje ciklbutanskog prstena -> razdvajanje pirimidinskih dimera

FADH- se pobuduje svjetloscu koji onda se pretvara u radikal te onda kroz radikalski mehanizam dolazi do odvajanja pirimidinskog dimera

Question 28

Objasni popravak ostecene DNA rekombinacijom

Answer 28

Popravak rekombinacijom se dogada u slucaju kada imamo nepopravljeni procijep u lancu DNA koji se replicira te kada replikacijske raslje dodu do te tocke one se “uruse” i prestaje replikacija

Problem je sto vise nema komplementarnog lanca koji kaze kako se treba “popraviti” ostecenje, ali zapravo ima, a on je zapravo drugi DNA kalup koji se normalno replicirao s druge strane replikacijskih raslji

Zatim dolazi RecBCD enzim koji helikaznom i egzonukleaznom aktivnoscu uklanja nukleotide dok ne dode do Chi mjesta -> lanac koji sadrzi Chi se vise ne cijepa nego se namotava u petlju (da bude duzi), a drugi lanac se svejedno skracuje egzonukleaznom aktivnoscu -> dolazi recA koji omogucava invaziju na drugi DNA lanac -> zatim dolazi ruvAB koji omogucava migraciju lanaca tj povezivanje komplementarnih lanaca sa dva kraja replikacijskih raslji -> zatim dolazi ruvC koji prereze lance koji su se krizali (gore dolje po replikacijskim rasljama) i DNA ligaza onda spaja te nastale fragmente i nastaju rekombinirani lanci DNA, ali najvaznije je da je zarez u lancu popravljen te je moguce dalje nastaviti replikaciju

Question 29

Sto se dogada u slucaju jako teskih ostecenja DNA?

Answer 29

Dolazi do pokusaja popravka DNA pod bilokoju cijenu -> cak i ako dode do mutacija, kromosmkih aberacija i slicno -> jedino je VAZNO da DNA bude cjelovita

NHEJ - nonhomologous end joining -> sparuje cijepane krajeve DNA koji si medusobno ne odgovaraju

Ostecenja koja su jako velika koja se ne mogu popraviti samo tako -> DNA polimeraze sklone grijesenju -> samo da kolko tolko poprave ostecenja, nevazno jesu tocno popravljena il ne