tecnología 2 parte 1 Flashcards
(39 cards)
- Fundamentos de la clonación de ADN
- Fundamentos de la clonación de ADN
¿Qué es la clonación de ADN desde la perspectiva de la biotecnología molecular?
Es el proceso de construir una molécula de ADN recombinante mediante la unión de fragmentos de ADN de diferentes orígenes, para su posterior replicación en una célula huésped
¿Cuáles son los cinco pasos fundamentales de la clonación de ADN?
1) Corte del ADN en sitios específicos mediante endonucleasas de restricción.
2) Selección de un vector de clonación capaz de autorreplicarse.
3) Unión covalente del ADN vector con el inserto mediante ADN ligasa.
4) Introducción del ADN recombinante en la célula huésped.
5) Selección de células huésped transformadas que contengan el ADN recombinante.
¿Qué es el ADN recombinante?
Es una molécula de ADN compuesta por fragmentos unidos covalentemente de dos o más fuentes genéticas distintas.
¿Qué papel juega la célula huésped en la clonación de ADN?
Proporciona la maquinaria enzimática para la replicación del ADN recombinante y la producción del producto génico de interés.
¿Qué sucede si alguno de los cinco pasos falla?
Si falla el corte, la inserción será ineficiente; si falla la unión ligasa, no se forma ADN recombinante; si falla la transformación, no se replica; si falla la selección, se pierden clones correctos.
¿Qué son las enzimas de restricción?
Son endonucleasas bacterianas que escinden el ADN dúplex en secuencias diana específicas, generando fragmentos definidos.
¿Qué característica tienen muchas secuencias reconocidas por enzimas de restricción?
Son secuencias palindrómicas, es decir, leen igual en ambas direcciones de la doble hélice
¿Qué es un ejemplo de palíndromo?
Ejemplos son frases que se leen igual al derecho y al revés, como: “Amo la pacífica paloma” o “La ruta natural”.
¿Qué tipos de extremos generan las enzimas de restricción?
Pueden producir extremos romos (“blunt ends”) o extremos pegajosos (“sticky ends”), lo que facilita la unión de fragmentos de ADN.
¿Qué ventaja tienen los extremos pegajosos sobre los romos?
Los extremos pegajosos tienen bases complementarias expuestas que facilitan la unión específica entre vector y fragmento de inserto.
¿Qué sucede si el inserto y el vector no comparten sitios de restricción compatibles?
Se puede utilizar la transferasa terminal para añadir nucleótidos al extremo 3’-OH, pero esto dificulta la recuperación posterior del inserto.
¿Cómo se soluciona la incompatibilidad de sitios de restricción?
Se sintetiza un enlazador palindrómico que contiene un sitio de restricción coincidente con el sitio del vector, facilitando la inserción controlada.
¿Qué problema tiene usar transferasa terminal en lugar de enlazadores?
El inserto puede perderse o integrarse en orientación errónea, y la excisión posterior se vuelve complicada.
¿Qué es un vector de clonación?
Es una pequeña molécula de ADN capaz de autorreplicarse, utilizada como vehículo para introducir fragmentos de ADN en una célula huésped.
¿Qué es un plásmido?
Es una molécula de ADN circular que se replica independientemente del cromosoma bacteriano.
¿Qué características debe tener un buen vector de clonación?
Ser pequeño, estable, tener sitios de restricción únicos, un marcador selectivo (como resistencia a antibiótico) y un origen de replicación eficiente.
¿Cuáles son las características del plásmido pBR322?
Tiene una fuente de replicación, dos genes de resistencia a antibióticos (tetR y ampR), varias secuencias únicas de restricción y un tamaño reducido de 4361 pb.
¿Qué sucede si el inserto interrumpe un gen de resistencia del vector?
Sirve como sistema de selección: la bacteria que pierde resistencia indica inserción exitosa
¿Qué es el bacteriófago lambda y su importancia como vector?
Es un virus bacteriano cuyo genoma puede reemplazarse parcialmente (~1/3) con ADN exógeno; solo se empaqueta en partículas infecciosas si tiene entre ~40 y ~53 Kb, permitiendo clonar fragmentos más grandes.
¿Por qué se usan bacteriófagos en lugar de plásmidos para fragmentos grandes?
Porque los plásmidos solo permiten clonar fragmentos relativamente pequeños (~20 kbp máx.), mientras que los fagos pueden aceptar fragmentos de 40–53 kbp.
¿Qué es un vector de expresión?
Es un plásmido modificado para introducir un gen de interés y garantizar su transcripción y traducción, permitiendo producir la proteína codificada.
¿Qué elementos contiene un vector de expresión típico?
Origen de replicación, polienlazador (MCS), marcador selectivo, promotor, operador, sitio de unión al ribosoma y un gen represor.
¿Qué función cumple el promotor en un vector de expresión?
Dirige la transcripción del gen insertado para producir ARN mensajero.
