Week 2 Flashcards
(109 cards)
1
Q
Welke DNA herstelmechanismen zijn er?
A
-BER
-NER
-Recombinatie herstel (HR, NHEJ)
-MMR
2
Q
Wat voor schade wordt hersteld door BER?
A
-Uracil
-Abasische sites
-8-oxoguanine
-ssDNA breuken
3
Q
Welke blootstellingen zorgen voor de schade die door BER hersteld wordt?
A
-Ioniserende straling
-Zuurstofradicalen
-Alkylerende stoffen
-Spontane reacties
4
Q
Wat voor schade wordt hersteld door NER?
A
-6-4 fotoproducten
-Pyrimidine dimeren
-Bulky adducts
5
Q
Welke blootstellingen zorgen voor de schade die door NER hersteld wordt?
A
-UV licht
-Polycyclische aromaten
6
Q
Wat is het centrale dogma van de moleculaire biologie?
A
- RNA synthese (transcriptie)
- Eiwitsynthese (translatie)
7
Q
Wat is de correlatie tussen kanker en leeftijd?
A
-Opeenstapeling mutaties (stochastisch)
-Ouderdomsziekte
-Kanker neemt va 60 exponentieel toe
8
Q
Wat zijn de 2 hoofdgroepen mutaties?
A
Puntmutatie: kleine veranderingen op basepaar niveau
Chromosomale afwijkingen: grote veranderingen, waar te nemen op chromosomaal niveau
9
Q
Wat voor puntmutaties zijn er?
A
- Transities (purine purine (A/G); pyrimidine pyrimidine (C/T))
- Transversies (purine pyrimidine of vice versa)
- Kleine inserties/ deleties
10
Q
Wat voor chromosmale afwijkingen zijn er?
A
- Translocaties: stukken DNA tussen chromosomen uitgewisseld
- Amplificaties: genen vermenigvuldigen
- Deleties
- Numerieke afwijkingen: verandering aantal chromosomen
11
Q
Wat zijn de oorzaken van DNA schade?
A
- Chemische instabiliteit (spontaan)
- Chemische verbindingen (veranderen spontaan)
- Biologische stoffen
- Fysische agentia
- Foutieve replicatie
12
Q
Wat voor soort DNA beschadigingen kunnen ontstaan?
A
- Chemische adducten
- Intrastreng crosslinks
- Interstreng crosslinks
- DNA strengbreuken
- Basepaar mismatches
13
Q
Welke reacties vinden plaats bij chemische instabiliteit?
A
- Spontane hydrolyse
- Deaminatie van basen
14
Q
Hoe verloopt spontane hydrolyse?
A
- Hydrolyse van de N-glycosyl-verbinding tussen suiker en base-> leidt tot depurinatie, abasische suiker
- Leidt tot 1 bp deletie bij replicatie
15
Q
Hoe verloopt deaminatie van basen?
A
- Aminegroep op cytosine verdwijnt: deaminatie. Leidt tot omzetting cytosine in een uracil-> verandering complementariteit
- Replicatie induceert mutatie. C->T (transitie)
16
Q
Hoe vaak vindt spontane hydrolyse plaats?
A
~9000 per cel per dag
17
Q
Hoe vaak vindt deaminatie van basen plaats?
A
~400 per cel per dag
18
Q
Welke transities door deaminatie vinden nog meer plaats?
A
C->T
A->G
G->A
C->T
19
Q
Welke biologische stoffen veroorzaken DNA schade?
A
- Endogene stoffen: zuurstofradicalen (geproduceerd door metabole processen, Reactive Oxygen Species ROS), oxidatieve DNA schade.
- Benzo(a)pyreen: aanwezig in sigarettenrook
20
Q
Hoe veroorzaken zuurstofradicalen DNA schade?
A
- Guanine + ROS-> 8-oxoguanine (nieuwe groep)
- Verandering complementariteit (replicatie induceert mutatie): 8-oxo paart met adenosine. G->T transversie
21
Q
Hoe vaak veroorzaken zuurstofradicalen DNA schade?
A
~400 per cel per dag
22
Q
Welke chemische adducten verstoren de DNA dubbelhelix niet?
A
- Spontane hydrolyse
- Deaminatie
- Oxidatieve DNA schade
23
Q
Hoe veroorzaakt benzo(a)pyreen DNA schade?
A
- Metabolisch geactiveerd: komt in cel terecht en wordt door een enzym omgezet in BPDE
- BPDE bindt aan DNA en veroorzaakt chemische adducten die de DNA dubbelhelix verstoren. Reageert vn met G residue, tegenover G-BPDE wordt een A residue ingebouwd, G-> T transversie
24
Q
Hoe zorgen fysische agentia voor DNA schade?
A
UV zorgt voor intrestreng DNA beschadigingen. Intrastrengs cyclopyrimidine dimeren via crosslinks (CPD) en 6-4 fotoproduct
25
Hoe vaak komt DNA schade door fysische agentia voor?
75.000 beschadigingen / cel / dag
26
Welke excisie reparatiemechanismen zijn er?
- Base Excisie Reparatie (BER)
- Nucleotide Excisie Reparatie (NER)
27
Wat zijn de kenmerken van base excisie reparatie (BER)?
- Enzymatisch proces
- Herstel van kleine adducten (oxidatieve DNA schade; deaminatie van basen; ssDNA breuken)
28
Beschrijf de stappen van BER
1. Herkenning DNA schade door schade-specifieke DNA glycosylase.
2. Excisie DNA schade: AP-endonuclease herkent AP-site en maakt een knip in het DNA, AP-site wordt verwijderd
3. Herstel (DNA polymerase en ligase)
29
Beschrijf de 1e stap van BER wat betreft deaminatie
Glycosylases scannen het DNA en herkennen vreemd nucleotide door 'bas flipping'
Deaminatie: Uracil DNA glycosylase (UNG) verwijdert ongewenste uracil en laat een abasische plaats (AP zonder purine of pyrimidine) achter.
30
Beschrijf de 1e stap van BER wat betreft oxidatieve DNA schade
8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) hydrolyseert de N-glycosyl verbinding tussen deoxyribose en 8-oxoG
Creert een abasische plaats (AP)
31
Wat zijn de kenmerken van nucleotide excisie reparatie (NER)?
-Herstel van grote adducten (cyclopyrimidine dimeren; 6-4 fotoproducten; bulky adducten)
-Traag proces
-30 eiwitten betrokken
32
Wat zijn de stappen van NER?
1. Herkenning DNA schade
2. Openen van omringende DNA om beschadigde streng te kunnen weghalen
3. Verwijderen DNA-schade (en aangrenzende gebieden van dezelfde streng)
4. Herstel door DNA synthese/ ligatie
33
Beschrijf de 1e stap van NER
1. Genome-wide scanning (traag). Laesie herkend door groep van 3 eiwitten: XPC, CETN2, RAD23B
2. Binden aan laesie
3. Vervolgens controleert een ander eiwitcomplex (UV-DDB) wat de DNA schade is.
34
Beschrijf de 2e stap van NER
Als schade herkend is komt RAD23B los-> signaal voor andere groep eiwitten om te binden waaronder TFIIH (XPB, XPG, XPA, eiwitcomplex betrokken bij transcriptie, bindt aan promotoren-> dubbelstreng opent zodat RNA polymerase kan binden, dmv helicase eiwitten). Ook CAK subcomplex en RPA
35
Beschrijf de 3e stap van NER
DNA excisie: knip begin stukje DNA door XPF (5'), 2e knip door XPG (3'), dan stuk DNA verwijderd
Point of no return
36
Welke soorten NER zijn er?
1. Globaal genoom NER (traag proces)
2. Transcriptie gekoppeld NER
37
Hoe onderscheidt transcriptie gekoppeld NER zich van globaal genoom NER?
1. Scanning door RNA pol II complex
2. Alleen DNA reparatie getranscribeerde streng actieve genen
38
Beschrijf trancriptie gekoppeld NER
Tijdens transcriptie door RNA polymerase kan het geblokkeerd worden als er DNA schade is. Als het te lang geblokkeerd wordt kan dat leiden tot celdood. CSB herkent dat er een blokkade is, mbv CSA wordt transcriptiecomplex naar achter geduwd: backtracking, om DNA schade plek vrij te maken zodat het verwijderd kan worden mbv NER (stap 2)
39
Wat zijn de rollen van NER?
GG-NER: voorkomen mutaties
TC-NER: voorkomen celdood
40
Wat zijn de gevolgen van defect GG-NER?
Xeroderma pigmentosum (XP): autosomaal recessief
Oorzaak: ten minste 8 genen XPA, XPB,...XPG
41
Wat zijn de klinische symptomen van xeroderma pigmentosum?
* zongevoeligheid
* droge, harde huid
* pigmentatie afwijkingen
* cataract
* huidkanker (>1000x↑)
* versnelde neurologische achteruitgang
42
Hoe wordt xeroderma pigmentosum behandeld?
“Children of the Moon”
* rigoreuze bescherming tegen blootstelling aan UV- en zonlicht
* speciale beschermende kleding (ESA/ NASA)
* regelmatige dermatologische controle en behandeling (incl. chirurgie)
43
Wat zijn de gevolgen van een TC-NER defect?
Cockayne syndroom (CS): autosomaal recessief
Oorzaak: 2 genen CSA, CSB, smane met XP: XPB, XPD, XPG
44
Wat zijn de klinische symptomen van cockayne syndroom?
* zongevoeligheid
* groei achterstand
* neurologische achteruitgang
* netvliesafwijkingen
* versnelde veroudering: veel celdood, stamcellen verdwijnen waardoor alles achteruit gaat
* GEEN huidkanker
45
Welke replicatie fouten kunnen optreden?
-Translesie synthese
-DNA polymerase proofreading fouten. Is nauwkeurig maar kunnen toch fouten optreden
46
Hoe treden fouten op bij translesie synthese?
Als replicatie geblokkeerd wordt en DNA polymerase niet verder kan komt translesie DNA polymerase om de blokkade voorbij te komen. Slordig DNA polymerase, onnauwkeurig waardoor mutaties kunnen achterblijven
47
Beschrijf het mechanisme van DNA replicatie
- Incorporatie van deoxyribonucleoside trifosfaten in nieuw keten DNA in 5'->3' richting
- Door DNA polymerase in katalytische site
48
Waarvan is de nauwkeurigheid van DNA replicatie afhankelijk?
1. Base selectie
2. Proofreading
3. Mismatch reparatie
49
Wat is base selectie?
De vorm van het katalytisch centrum van DNA polymerase wordt mede bepaald door de identiteit van de base in de template streng
50
Wat is proofreading?
Proton kan spontaan verplaatsen, amino tautomeer (C) verandert in imino tautomeer waardoor C baseparing vormt met A. Kan ook T met G enz. Kan spontaan weer terugveranderen waardoor de baseparing wordt afgebroken.
DNA polymerase herkent dit en heeft exonuclease activiteit: haalt cytosine weg en bouwt correcte thymine in, proofreading. 99,9% efficiency
51
Wat is mismatch reparatie (MMR)?
Als er toch een mismatch is herkennen reparatieeiwitten (MLH1, PMS2, MSH6, MSH2) dit en recruteren EXO1 (exonuclease) dat een deel van de gemuteerde streng verwijdert, DNA polymerase herstelt de streng weer
52
Wat veroorzaakt Lynch syndroom?
Mismatch reparatiedefect
53
Hoe kan een mismatch reparatiedefect aangetoond worden?
1- Immunohistochemische kleuring
2- Microsatellite instability assay (MSI)
54
Hoe werkt immunohistochemische kleuring?
Gebruik specifieke antilichamen om te kijken of eiwitten van de MMR aanwezig zijn. Verkeerd gevouwen eiwit wordt toch aangekleurd, dan optie 2
55
Hoe werkt microsatellite instability assay (MSI)?
-Microsatellieten bestaan uit korte repeterende sequenties, meestal di-, tri- of
tetranucleotide repeats
-Defecte MMR leidt tot microsatelliet instabiliteit
-Bij reannealing kunnen dingen misgaan: binden niet waar zou moeten, als MMR niet werkt krijg je insertie of deletie van een repeat in nieuwe DNA streng
-PCR op DNA tumor en normaalweefsel: defecte microsatellieten hebben verschillende lengtes. Replication error (RER) fenotype
56
Wat zijn de oorzaken van coloncarcinomen?
75% sporadisch
18% familiair belast
5% Lynch syndroom
1% IBD
1% FAP
57
Wanneer is er sprake van Lynch/ erfelijk CRC?
Bethesda criteria:
1. CRC < 50 jaar
2. Tweemaal CRC of CRC icm andere Lynch geassocieerde tumor
(synchroon/metachroon) bij één patiënt
3. CRC met MSI < 60 jaar
4. CRC bij een patient met een of meer eerste/tweedegraads familieleden
met Lynch syndroom geassocieerde tumor (tenminste eenmaal < 50 jaar)
5. CRC bij een patient met twee of meer eerste/tweedegraads familieleden
met een Lynch syndroom geassocieerde tumor
58
Wat zijn de Lynch syndroom geassocieerde tumoren?
Baarmoeder, eierstok, hogere urinewegen, maag, alvleesklier, galwegen, dunne darm, talgklieren, hersenen
59
Wat wordt gedaan bij mogelijkheid op Lynch syndroom?
Klinische geneticus:
1. Stamboom
2. Bepalen of en bij wie in de familie moleculair onderzoek gestart moet worden
->aangedane persoon, beschikbaar tumorweefsel; DNA-repair schade?
3. Voor- en nadelen moleculair onderzoek bespreken
4. Moleculair onderzoek; kiembaanmutatie (# tumor!)
5. Adviezen
60
Wat zijn verwijscriteria voor Lynch onderzoek zonder CRC?
Eerstegraads familielid CRC < 50 jaar (indien dit aangedane familielid zich zelf niet wil of kan laten verwijzen)
Drie of meer (eerste- of tweedegraads) familieleden CRC (of een met Lynch syndroom geassocieerde maligniteit*) < 70 jaar.
Kiembaanmutatie in één van de mismatch repair genen in de familie
61
Wat zijn de risico's van Lynch syndroom?
Life time risico op CRC tot 70%
->Vaak <50 jaar
->In 25% meer dan 1 tumor bij diagnose
Life time risico endometriumcarcinoom tot 55%
- Andere geassocieerde tumoren 1-15%
62
Wat zijn de kenmerken van CRC bij Lynch syndroom?
-Tumoren meestal rechtszijdig (later klachten)
-Vaak slecht gedifferentieerd
-veel mucus, zegelring-cellen
-tumor-infiltrerende lymfocyten, MSI, neoantigenen
in de tumor
63
Wat zijn de surveillance adviezen bij Lynch syndroom?
(Geen maligniteit) va 25 jaar 1x per 2 jaar coloscopie
Bij vrouwen van 40-60 ook screenen voor endometriumcarcinoom. Actief zoeken naar ovariumcarcinoom is niet zinvol
64
Waarom wordt niet gescreend op overige tumoren bij Lynch syndroom?
-Frequentie laag
-Sensitiviteit en specificiteit testmethodiek(en)
-Geen bewezen effect op klinische uitkomst
65
Wat is het beleid bij een Lynch geassocieerd CRC?
Totale colectomie bij ontwikkelen CRC, als >60 partiele colectomie
Vormen CRC waarbij MSI is aangetoond doen het heel goed op immunotherapie: PD-1 remmers bij gemetastaseerd MSI CRC
66
Wat zijn de preventieve overwegingen bij Lynch?
-Preventieve chirugie voor endometrium- en ovariumcarcinoom kan een optie zijn
-Geen preventieve chemo/ immuno
67
Wat is het screeningsbeleid bij familiaire belasting CRC?
Minder agressief dan bij Lynch:
10% lifetime risk
(Preventieve) colonoscopie 1 x per 5 jaar vanaf 50 jarige leeftijd
68
Wat is BEP?
Bleomycine: dubbelstrengs DNA breuken
Etoposide: topoisomerase remmer
Cisplatine: interstrand crosslinks
69
Wat is het doel van anti-kanker therapie?
Inductie van celdood ipv kanker na DNA schade
70
Hoe werkt topoisomerase II?
TopII zorgt ervoor dat 2 DNA strengen uit elkaar gehaald worden:
-Knipt ene streng en blijft eraan hangen
-Vangt andere streng en haalt die erdoor, daarna streng weer aan elkaar gezet
71
Hoe werkt etoposide?
-Remt topoisomerase II
-Laat 1e deel reactie nog toe waarbij dubbelstrengs breuk in DNA met aan uiteinden covalent gebonden eiwit wordt gemaakt, remt 2e deel waarbij breuk weer aan elkaar wordt gezet-> bevriest eiwit-DNA complex, abnormale breuken. Als probeert te verdubbelen in S-fase leiden al deze breuken tot chromosomale afwijkingen, als daar te veel van zijn gaat de cel dood
72
Welke vormen van therapie op maat voor kanker zijn er?
1. Tumoren in BRCA mutatie dragers (defect HR)
->BER en enkelstrengsbreuken
->DNA dubbelstrensbreuken in context van DNA replicatie
2. Hyperthermie als anti-tumor therapie
73
Wat is synthetische letaliteit?
Er zijn 2 reparatiemechanismen voor DNA schade:
1. Aanwezig in tumor- en normale cellen
2. Alleen in normale cellen
Door remming van 1 gaan alleen de tumorcellen dood
74
Wat doet PARP1?
Bindt aan enkelstrengs DNA breuken en modificeert eiwitten met poly ADP ribose
Maakt reparatie van enkelstrengs breuken tijdens BER efficienter
75
Wat gebeurt er bij replicatie van DNA met een enkelstrengs breuk?
-Resulteert in een eenzijdige dubbelstrengs breuk
-Geen herstel door NHEJ doordat er geen 2e DNA uiteinde is
-Homologe recombinatie essentieel voor herstel
76
Hoe wordt replicatie geassocieerde eenzijdige dubbelstrengs breuk hersteld?
Door homologe recombinatie:
Mbv RAD51 filamenten recombinatie van strengen-> nieuwe DNA replicatie vork-> probleem hersteld
77
Welk percentage van borstkankers is erfelijk?
5%
78
Welke mutaties verhogen de kans op borstkanker en welke kankers hebben nog meer een verhoogd risico?
Dragers met BRCA1 of 2 mutaties (heterozygoot)
Deficient in homologe recombinatie
Borst-, ovarium- en prostaatkanker
79
Hoe erft het fenotype van BRCA1 en 2 mutatie dragers over?
Autosomaal dominant
Inactivatie van het gezonde allel in tumorcellen (LOH loss of heterozygocity)
80
Hoe wordt synthetische letaliteit bij een BRCA deficientie toegepast?
1. PARP remmer-> efficientie ss breuk herstel omlaag
2. Ophoping van dubbelstrengs breuken
3. Normale cel is HR proficient, tumorcel is HR deficient waardppr alleen de normale cellen kunnen herstellen
81
In welke stappen zijn PARP remmers getest?
1. Experimenten met cellijnen
2. Dierexperimenten
3. Klinische studies: fase I toxiciteit, fase II werkzaamheid, fase III grote populatie
82
Wat waren de resultaten van de experimenten met cellijnen van PARP1 remmers?
BRCA2-deficiente cellen gevoelig voor behandeling bij 2 verschillende PARP1 remmers
83
Hoe werden PARP1 remmers op muizen getest?
Xenograft: menselijke BRCA2-proficiente tumorcellen in ene dijbeen en BRCA2-deficiente tumorcellen in ander
Grootte in tijd bijgehouden
84
Wat waren de resultaten van de dierproeven met PARP1 remmers?
Deficiente tumor neemt snel af in grootte na PARP remmer
85
Wat waren de resultaten van de fase II studie van PARP1 remmers?
Enorme verlenging overleving bij ovariumkanker, bij borstkanker in overall survival nauwelijks effect. Wel verbetering progression free-survival dus mag klinisch toegepast worden
86
Waarom werken PARP1 remmers zo 'slecht' voor borstkanker?
-3e pathway die DSB kan repareren: TMEJ teta mediated end joining, afhankelijk van DNA polymerase teta (polQ)
-Gebruikt een paar nucleotiden homologie
-Alternatief voor HR
-POLQ remmers?
87
Wat is hyperthermie?
Lokaal verwarmen tumor
-60-90 minuten
-41-43 C
-Vergroot o.a. effectiviteit radiotherapie
88
Welk eiwit is belangrijk voor dubbelstrengs DNA breukherstel door HR?
-RAD51 eiwitmoleculen vormen een filament op de enkelstrengs staart
-Het RAD51 eiwitfilament bevordert baseparing tussen het gebroken en intacte zusterchromatide
89
Hoe wordt het gedrag van RAD51 na het ontstaan van DNA schade beinvloed?
Door de BRCA1 en 2 eiwitten: 1 om enkelstrengs DNA te maken en 2 om RAD51 daar te brengen. Bij BRCA2 deficiente cel geen ophoping van RAD51 op DNA schade
90
Wat is het effect van hyperthermie op HR?
Zorgt er o.a. voor dat HR niet meer goed werkt: BRCA2 wordt afgebroken-> BRCA2 deficiente cel
91
Wat is het effect van een combi van hyperthermie en PARP remmer?
Tumoren groeien minder snel bij PARP remmer i.c.m. hyperthermie
Op meer tumoren toepasbaar
92
Hoe is DNA opgebouwd?
Suiker-fosfaat backpone met basen
93
Hoeveel bindingen zitten er in de baseparingen?
A-T baseparing: 2 H-bruggen
C-G baseparing: 3 H-bruggen
94
Hoe werkt PCR?
1. Temperatuur verhoogd zodat de 2 DNA strengen uit elkaar gaan (denaturatie)
2. Temperatuur verlaagd-> primers binden aan DNA
3. Iets hoger temperatuur: Taq polymerase bindt aan primer en bouwt nucleotiden in
4. Cyclus herhaald. Na 3 cycli begint de target sequence te accumuleren (1->2->1 miljard)
5. Na 30 cycli zijn er 1 miljard kopieen van de target sequence
95
Waarvan is Taq polymerase afkomstig?
Bacterien die DNA polymerase bevatten die tot 120 C stabiel is
96
Hoeveel basen zitten er in het humane genoom
3 miljard
97
Wat wordt er met sequencing gedaan?
Met DNA sequencing wordt de volgorde van de 4 nucleotiden – “basen” – bepaald waaruit het DNA molecuul bestaat
98
Welke mutaties kunnen in een codon optreden?
Silent mutatie: verandering in DNA, aminozuur hetzelfde
Missense mutatie: ander aminozuur
Nonsense mutatie: stop codon
99
Wat zijn de toepassingen van DNA-sequencing in de oncologie?
Differentiaal diagnostiek (diagnose A of B)
Therapiekeuze (therapie A of B)
Clonaliteitsanalyse (metastase of 2e primaire tumor)
Oncogenetica (erfelijke tumorsyndromen) ism Klinische Genetica
Weefselidentificatie (weefsel van pt A of pt B)
100
Wat is het principe van next generation sequencing (NGS)?
Gekeken naar single molecules: unieke DNA moleculen apart bekeken, allemaal tegelijk (massively parallel). Targeted sequencing (1 specifiek target region)
101
Beschrijf de 2 alternatieve processen voorafgaand aan NGS
1. Amplicon enrichment mbv PCR (vermenigvuldigen target sequence). Daarna adaptor ligation aan beide kanten streng + denaturatie-> klaar voor sequencing
2. Hybridization enrichment: hele DNA molecuul fragmenteren, dan adaptor ligatie en denaturatie. Target region selecteren met complementair stukje DNA met biotine molecuul (probes) eraan->bindt aan beads-> beads uitfilteren met magnetisme of gewicht-> klaar voor sequencing
102
Beschrijf het proces van NGS
1. Hybridiseren DNA fragmenten met adaptors aan complementaire primers op flowcels
2. PCR zodat dubbelstreng ontstaat
3. Denaturatie, ssDNA niet verbonden aan flow adaptor weggespoeld
4. Bridge bulding: adaptor aan uiteinde hybridiseert met andere adaptor op cell
5. Bridge amplificatie. Er ontstaan clusters DNA fragmenten
6. Sequencing met primers en fluorescente nucleotiden, bij elke aanbouw wordt een foto gemaakt
103
Hoe worden samples op een flowcel van elkaar onderscheiden?
Meerdere regio's met verschillende fragmenten en meerdere patiënten op 1 flowcel (onderscheiden dmv barcodes). Voor en achter elke regio van interesse specifieke nucleotidevolgorde gehangen (barcode, voor elke patient anders, bv AAAA of TTTT)
104
Hoe wordt NGS data verwerkt?
Alignment van unieke DNA moleculen (reads) tot de referentie DNA. Vaak normale nucleotiden wegfilteren zodat alleen overblijft wat anders is dan de referentie
105
Wat is de variant allel frequentie?
VAF: aantal malen dat een variant op een specifieke positie gevonden is t.o.v. referentie: variant/coverage x 100%)
VAF bij tumorcelpercentage 25% is 12,5% (1/2 afwijkend in tumorcel). Hoe hoger de tumorcelpercentage hoe lager je depth nodig is. Hoe deeper gesequnced hoe lager de VAF is die je kan ontdekken
106
Waarvan is de VAF afhankelijk?
- Gen (oncogen vs tumor-suppressor-gen)
- Tumorcelpercentage
107
Wat is coverage (deep sequencing)?
Aantal malen dat een base-positie (onafhankelijk) bepaald is
Hoe hoger de coverage hoe “deeper” gesequenced
Whole Genome Sequencing (WGS) of Whole Exome Sequencing (WES) < 100 x deep.
Targeted sequencing (honderden tot enkele duizenden fragmenten): 500 x - tienduizenden x deep.
108
Wat zijn de kenmerken van NGS?
single molecule
duizenden fragmenten/analyse
output 1 – 20 x 109 basen
weinig DNA nodig (~20 ng)
hoge gevoeligheid (1-2%)
poolen van samples (barcode)
bio-informatica vereist
109
Wat zijn de kenmerken van Sanger sequencing?
mix van moleculen
1 fragment/analyse
output max 1000 basen
veel DNA nodig
lage gevoeligheid (20%)
poolen niet mogelijk
eenvoudige analyse
