COURS 2 METHODE D'ETUDE DE BIOCELL

Question 1

Culture cellulaire
objectif
protocole
cas des lignées cellulaire

Answer 1

Culture primaire : tissus in vivo prelevemnt dissociation des cellule et mise en culture
Culture secondaire : soit cellule en suspension
soit cellule adherente avec traitement a la trypsine
Objectif : Production IN VITRO de cellules dans un environnement favorable et contrôlé en vue d’expérimentations scientifiques.

Protocole : Prélèvement - Dissociation - Mise en culture

cas des lignées cellulaire : - Cellules immortelles (cancéreuses) ou rendues immortelles (infection, génie génétique…), que l’on peut maintenir en culture indéfiniment
- Pas de sénescence
- Peu d’apoptose
- Mitose facilitée
- Utilisées en laboratoire pour la recherche
- faible dépendance au facteur de croissance
ne proviennent pas directement d’un organisme pluri cellulaire

Question 2

utilisation des anticorps
obj
principe
definition epitote et paratote

Answer 2

Objectif : Marquer une protéine ou une structure SPÉCIFIQUEMENT.

Principe : Un anticorps est capable de se fixer à un antigène et de former un complexe Ac- Ag. Marqués, ils mettent en évidence la biomolécule d’intérêt et permettent son étude.

Définitions :

• Epitope (déterminant antigénique) : région d’un antigène reconnue par le paratope
• Paratope : site de liaison à un épitope de l’antigène

Question 3

2 types d’anticorps

Answer 3

Anticorps monoclonaux
Mélange d’anticorps identiques, qui ne reconnaissent qu’un seul épitope.

Anticorps polyclonaux
Mélange de multiples anticorps reconnaissant
chacun un seul épitope spécifique, mais qui ensemble reconnaissent de multiples épitopes d’un même antigène (Ac monospécifique) ou de plusieurs antigènes (Ac polyspécifique).

Question 4

2 types de marquage

Answer 4

Direct
L’anticorps qui se fixe à l’antigène est marqué.

Indirect
Un premier anticorps non marqué spécifique de l’antigène est introduit puis un second anticorps marqué spécifique du premier anticorps est introduit.
-> amplifie le signal

Question 5

Immunomarquage
obj
principe
protocole

Answer 5

Objectif : LOCALISER les protéines dans les tissus

Principe : On met des anticorps marqués (fluorescence, radioactivité, enzyme, …) sur les coupes et si la biomolécule possédant l’épitope adéquat est présente, elle sera visualisable.

Protocole : Prélèvement soigneux du tissu - Utilisation de fixateurs (notamment le formol) - introduction des anticorps marqués - observation à la lumière naturelle en microscopie optique

Question 6

IMMUNOHISTOCHIMIE
principe
observation

Answer 6

Principe : Le marqueur conjugué à l’anticorps est une enzyme. Si l’anticorps se fixe, il y a catalyse d’une réaction qui convertit un substrat incolore en un substrat coloré.

Observation : Microscope optique

Question 7

immunofluorescence
principe
observation

Answer 7

Principe : Le marqueur conjugué à l’anticorps est un fluorochrome (ou fluorophore). Le marquage peut être direct ou indirect.

Observation : Microscope UV à fluorescence

Question 8

marquage par fluorescence
principe
specifite
observation

Answer 8

Principe : Molécules qui, excitées par une lumière d’une certaine longueur d’onde spécifique, ré- émettent de la lumière de longueur d’onde supérieure.

Spécificité :
organite (DAPI = ADN)
fonction (iodure de propidium = viabilité cellulaire).

Observation : microscope optique.

Question 9

proteine de fusion

et tag

Answer 9

Principe : protéines artificielles composées de 2 “sous-protéines” :
-> d’une part, la protéine d’intérêt, celle que l’on souhaite observer.
-> d’autre part, une autre protéine qui nous permet de suivre l’évolution spatio-temporelle de la
protéine d’intérêt.

Il s’agit d’une fusion entre la protéine d’intérêt et une protéine servant d’étiquette. Il permet d’extraire une protéine mais aussi de la repérer plus facilement. les tags n’interagissent jamais

Question 10

L’electrophorese
obj
protocole

Answer 10

Objectif : séparer les molécules selon leur taille et leur
charge, sous l’influence d’un champ électrique.

Protocole :
- charger - les molécules
- les dépose sur un gel
- Elles migrent vers l’anode (côté +) en fonction de leur
poids moléculaire
- Puis on transfère le tout sur une membrane en cellulose
- Enfin, on marque.

Plus la molécule est légère, plus elle migre sur le gel !
Plus elle est lourde, plus elle sera retenue dans les mailles du gel

Question 11

Western blot
obj
principe

Answer 11

Objectif : Étudier l’EXPRESSION de protéines dans les tissus

Principe : Séparer la (ou les) protéine(s) à l’aide d’une électrophorèse puis révélation de celle(s)-ci grâce à un anticorps marqué.

Question 12

Comment analyser un western blot

Answer 12

Un WB s’analyse par colonne !
Au-dessus de chaque colonne se trouve la condition dans laquelle on se trouve.
A droite nous avons la molécule étudiée pour chaque ligne. On ne peut pas comparer les molécules entre elles.
Pour que les résultats soient corrects, il faut déposer la même quantité dans chaque échantillon !

Question 13

Northern blot
southern blot

obj
principe

Answer 13

Objectif : séparer les acides nucléiques (ARN pour le N et ADN pour le S) selon leur taille et leur charge sous l’influence d’un champ électrique.

Principe :

• Obtention d’un acide nucléique monobrin marqué, de séquence complémentaire à celle de l’acide nucléique cible.
• Incubation avec les acides nucléiques cibles puis hybridation (association de la sonde marquée avec le brin cible selon la complémentarité des bases)
• Révélation du marquage.

Ces méthodes n’utilisent pas d’anticorps, mais des sondes marquées !

Question 14

L’immunoprecipitation
obj
protocole

Answer 14

Objectif : Isoler une molécule d’un échantillon : on met un anticorps lesté (ajout d’un élément lourd) dans le milieu avant centrifugation => la protéine d’intérêt sera donc dans le culot.

Protocole :

• Ajout d’un anticorps anti A qu’on leste
• Formation d’un complexe « Ac anti A – protéine A » - Centrifugation
• Récupération du culot contenant la protéine A

Question 15

la co-immunoprecipitation
obj
protocole

Answer 15

Objectif : réaliser une immunoprécipitation sur une protéine A, mais rechercher une protéine B sur le
Western Blot, afin de mettre en évidence une interaction.

Protocole :
- Ajout d’un anticorps anti A lesté dans un tube à essai contenant une protéine A et B
- Formation d’un complexe « Ac anti A – protéine A »
- Centrifugation
- Récupération du culot contenant la protéine A
- Western blot avec un anticorps anti-B pour voir si la protéine B s’est accrochée à A.
L’interaction peut être directe ou indirecte (par le biais d’une ou plusieurs autres protéines).

Question 16

La ChIP (immunoprecipitation de la chromatine)
obj

Answer 16

Objectif : mettre en évidence une interaction entre une protéine et une séquence d’ADN particulière. La ChIP permet notamment d’identifier les sites de liaison d’un facteur de transcription sur l’ADN in situ.

Question 17

Centrifugation
obj
protocole
principe

Answer 17

Objectif : Elle permet de séparer les différents constituants cellulaires en fonction de leur masse
grâce à une rotation à grande vitesse.

Protocole :

• Dissociation et lyse cellulaire (destruction de la membrane plasmique)
• Centrifugation
• Recueil des différents culots
• Analyse des culots pour identifier les organites.

Principe : L’accélération entraîne les particules vers le fond du tube.

pour a gradient de densité : soit solution de saccharose soit sol de chlorure de sodium et la concentration la plus eleve en bas
Coef de Svelberg : proteine des premiere fraction ont le coef le + eleve
parmis peroxysome, lysosome et mitochondrie
pero a le + eleve et lysosome le - eleve

Question 18

Cytometrie de flux
obj
protocole

Answer 18

Objectif : trier et séparer des cellules isolé selon l’intensité de la fluorescence émise, ce qui leur permet d’être classées selon des critères comme la taille ou la granulosité et donc fluorescence
constitué de 3 parties : banc optique, reseau fluidique et microprocesseur

Protocole :
- On dirige des anticorps marqués par fluorescence contre certains éléments cellulaires (protéine de surface, ADN…).
- La suspension de cellules est introduite dans un canal.
- Les cellules passent une à une à travers un banc optique, conversion des signaux lumineux en signaux électriques.
- Le signal fluorescent est recueilli par des photodétecteurs (photodiode).
- Les données sont analysées qualitativement et
quantitativement par un ordinateur.
- Les cellules peuvent être triées et séparées selon le signal obtenu ; celles qui présentent des caractéristiques communes sont regroupées dans un même tube collecteur.

Question 19

Manipulation genetique

obj

Answer 19

Objectif : étudier la fonction d’une protéine d’intérêt en augmentant ou en inhibant l’expression
du gène.
On peut réaliser ces manipulations :
• In vitro : dans des lignées cellulaires
• In vivo : dans un animal ou un embryon
On peut :
• Surexprimer un gène : Knock In (KI)
• Supprimer un gène de tout l’organisme : Knock Out total
• Supprimer un gène dans un seul tissu : Knock Out spécifique

Question 20

Les siARN

princiê

Answer 20

Principe : Le siARN (=shARN) est un petit ARN double brin fabriqué artificiellement qui est exactement complémentaire de l’ARNm codant pour une protéine. En s’hybridant avec, il provoque la destruction de l’ARNm et bloque donc sa traduction en recrutant le complexe RISC (assurant la dégradation). Ainsi, la protéine n’est pas exprimée et l’on peut alors retrouver la fonction qu’elle avait au sein de la cellule.

Question 21

Systeme Cre/Lox

obj
principe pour KO
principe pour KI

Answer 21

Objectif : Knock Out ou Knock In d’un gène
Principe pour le KO :
1. On prend une lignée de souris qui exprime la cre-recombinase et on les croise avec les souris exprimant le gène d’intérêt qui est situé entre deux séquences lox insérées dans le génome (region of interest sur le schéma).
2. La cre détecte les séquences lox et clive le gène d’intérêt à leur niveau.
Principe pour le KI :
Même principe sauf que l’on vise les séquences « STOP cassettes » qui inhibe l’expression des gènes.

Question 22

CRISPR Cas/9
obj
principe

Answer 22

Objectif : modifier le génome grâce à des ciseaux moléculaires, inspiré des mécanismes
de défense des bactéries contre les virus.
Principe :
1. On crée artificiellement un ARN complémentaire d’une séquence d’ADN d’intérêt
2. On utilise Cas9, une enzyme qui contient l’ARNsg qui s’hybride à la séquence d’ADN homologue.
3. L’ARNg va guider Cas9 qui sera ainsi complémentaire de la séquence.
4. Quand l’ARNg a trouvé la séquence complémentaire, Cas9 va pouvoir cliver le génome exactement 3 nucléotides avant la PAM