HC 9 - Proteomics II Flashcards
Hoorcollege 9
Waarom is de data van bottom-up proteomics incompleet?
-Proteases (vaak trypsine) en limitaties van de massa range van de massaspectrometer
-Niet alle peptiden zijn informatief voor identificatie en kwantificatie
-Sample complexiteit en duty cycle (meetcyclus) limitaties in Data Dependent Analysis
-Een grote dynamic range van het proteoom (niet alle eiwitten zijn in gelijke hoeveelheid en dus intensiteit aanwezig en je kunt ze missen)
workflow proteomics
-Extractie
-Digestie
-Purificatie
-LC-MS analyse (MS > MS^2)
-Proteeom database search
Hoe kan vouwing van een eiwit de resultaten verpesten?
Trypsine kan disulfide bruggen tussen de cysteïneresiduen knippen maar soms knipt deze niet goed en houd je deels gevouwen pepides over waar de digestiemix niet bijkan en dan blijven ze aan elkaar vastzitten
Wat doen TCP en CAA
TCP reduceert disulfidebruggen en hervorming wordt voorkomen door CAA toe te voegen die de cysteïnes modificeert met hydroxymethylatiegroep
Waarom is de MS meting onvolledig?
De MS informatie zegt alleen wat over de gemapte (in MASCOT rood) stukjes die met fragmentspectra bepaald zijn en zijn gematched aan een eiwit.
> je hebt geen info over delen van het eiwit die geen coverage hebben en variatie in dit gebied is niet gemeten
> je kunt geen PTMs van een non-mapped peptide meten omdat je geen fragmentspectrum hebt
Trypsine peptidase functies en nadeel
Knipt carboxyterminaal van en lysine (Lys, K) of Arginine (Arg, R) aminozuur.
> niet alle eiwitten hebben in alle stukkje lysines en arginines dicht bij elkaar zitten waardoor er fragmenten ontstaan die buiten de window of measurement liggen omdat de precursor te lang is.
Waarom bepaal je een window of measurement bij MS?
Omdat we niet geïnteresseerd zijn in hele korte en lange stukken (minder betrouwbaar??)
In welke eenheid meten we peptide massa of aminozuur massa? Hoeveel is dit per H molecuul (proton)?
amu / u
1.007 amu per H
Welke delen van de precursor zijn geladen bij tweevoudig geladen?
De laatste lysine en de aminogroep
Neutral peptide mass =
(m/z)z-(zH)
Unieke peptide / proteotypische peptide
Een deel van de lijst van peptiden die uniek voorkomt in 1 eiwit
Wat kun je zeggen na MS over je sample en protein groups?
Je hebt bewijs dat de protein group in de sample zit maar niet altijd welke eiwitten in de sample zitten
> protein interference
Wanneer is een peptide niet informatief?
Wanneer het niet aangeeft welke eiwitten er in het sample zitten.
Wat kun je zeggen over kwantificatie wanneer een peptide in meerdere eiwitten voorkomt?
Je kunt ze niet goed kwantificeren (shared)
> als deze twee eiwitten ook een peptide hebben die uniek is voor het eiwit dan kan het wel gekwantificeerd worden: proteotypisch.
Kwantificatie bij unieke peptiden
Ratio’s berekenen van unieke peptides tussen de samples om verschillen te kwantificeren in eiwit abundantie
> kan ook voor sommering van aantal eiwit voor de unieke peptiden en dan het ratio voor de eiwitwaarde voor intensiteit (zelfde eiwit tussen twee samples)
Wat geeft in de massaspectrum de kwantificatie aan?
Het oppervlakte onder de pieken
De limitatie van de massaspec duty cycle bij LC-MS
Na 10 seconden is een piek weg en de massaspectrometer moet dan detecteren, selecteren en fragmenteren.
> de chromatogram loopt door met loslaten van hydrofiel naar hydrofoob maar de detector heeft maar een korte tijd om de peptiden te selecteren en te fragmenteren om fragmentspectrum te maken.
> er is een limiet aan hoeveel fragmentaties er tegelijk gedaan kunnen worden: nieuwe peptiden die van de kolom afkomen kunnen daarboven niet gemeten worden.
Waarvan is de soorten peptiden die we per eiwit meten afhankelijk?
Van de peptidase > indien trypsine afh van de lysine-arginine koppeling.
Bij een 100 Hz fragment spectrum frequentie zorgt bij 60 minuten gradient in de LC voor 360,000 spectra en theoretisch bij 24h voor 8.6 mln spectra. Toch ligt het maximum lagerL op 1.6 mln theoretisch. Waarom?
Omdat
-de massaspectrometer selecteert en fragmenteert soms dezelfde peptide meerdere keren > herselectie
-groter aantal precursors door isotopen
-het is veels te langzaam tevens
Raken peptiden bij een 24h theoretisch gezien niet op? Wat is het nadeel?
Nee, maar het grote nadeel is dat je de oppervlakte onder de piek uitsmeert over langere tijd, daardoor is onderscheid misschien beter omdat de pieken niet allemaal over elkaar komen te liggen (dat is het doel), maar omdat je doorslaat worden de pieken zo laag dat de achtergrondsruis alle pieken verbergt. Daarom is er dat maximale peptide meting van 1.6 mln.
Hoe kan in kortere tijdsgradiënt toch meer worden gemeten?
Hogere frequentie (Hz) > meer tegelijk meten dus sneller meten
Limitatie dynamic range: voorbeeld met bloed
Het bloed bestaat 95% uit albumine als eiwit maar interessanter voor detectie zijn de interleukines die veel minder voorkomen omdat ze worden overschaduwd en daarom niet in de meting worden meegenomen.
> als er meerdere geladen deeltjes bij de detector aankomen dan wordt een klein aantal peptiden met lading 1 niet geselecteert omdat het niet hard genoeg ‘schreeuwt’.
