3 Flashcards
(18 cards)
İzotermal veya Gibson DNA Assembly nedir?
İnsert ve vektör arasında tamamlayıcı tek iplikli çıkıntılar(overhang) üretilir. Bunları oluşturmak için 5’ eksonükleaz kullanılır. Her bir fragment, bir örtüşme (overlap) olarak adlandırılan bitişik DNA ile aynı sekansa sahip 20-30 bp bölge ile yapılır.
Bu örtüşen diziler kuyruklu PCR primerleri kullanılarak eklenebilir.
İzotermal veya Gibson DNA Assembly’de hangi enzimler kullanılır?
DNA eksonükleaz, DNA polimeraz, DNA ligaz içeren enzim karışımı fragmentlere eklenir. Eksonükleaz her bir uçta 3’ tek iplikli (overhang) oluşturmak için parçaların 5’ucundan nükleotit degrede eder.
İzotermal veya Gibson DNA Assembly’de ne zaman bağlanma gerçekleşir?
Daha düşük sıcaklıklarda.
Tepkimenin tamamı 50C de gerçekleşir.
Daniel Gibson ve Craig Venter 2009 yılında ne yapmışlardır? Ve araştırmaları neden devrim niteliğindedir?
*Canlı hücre oluşturmak için minimum geni bulmaya çalışmışlar.
*Reaksiyonun tek bir tüpte gerçekleşmesi, 1 saatten kısa sürmesi ve 10 kb ve hatta daha büyük parçaları bile bir araya getirebilmesi açısından… devrim
*Gibson Assembly, modern moleküler biyolojide devrim yaratan bir tekniktir. Özellikle yüksek doğruluk gerektiren sentetik biyoloji ve genetik mühendisliği çalışmalarında geniş çapta kullanılır. 5’ ekzonükleaz, polimeraz ve ligazın koordineli çalışması sayesinde, DNA fragmanları zahmetsizce birleştirilir ve klonlama işlemi basitleştirilir.
Gibson assemblyde kesim enzimlerine gerek var mı?
Hayır yok.
Gateway klonlama nedir?
Lambda bakteriyofaja dayanmaktadır.
Lambda genomunun entegrasyon ve kesim bölgeleri kullanılır.
Entegrasyon sırasında lambda bakteriyofajındaki hangi dizi ve E.colideki hangi dizi birleşir?
Lambdanın attP dizisi ve E.coli’nin attB adlı dizileri birleşir.
Fajdaki hangi protein gateway klonlamada rekombinasyon olayını yönetir? Ve ne yapar?
Fajdaki int proteini (integraz)
Bakteriyofaj DNAsının her bir ucunda attL ve attR DNA sekansının yaratılmasıyla sonuçlanır.
Gateway klonlamada kesim sırasında hangi proteinler faj DNAsını çıkarmak için çalışır?
int protein ve xis proteini kullanılır ve hedef vektörde bulunan ccdB adlı bir genle değiştirilir.
Gateway sisteminin ilk adımı nedir?
Insertu iki attL bölgesine sahip olacak şekilde oluşturmaktır.
attL1 ve attL2 nedir?
Giriş vektörüne girdikten sonra, insert, attL1 ve attL2 tarafından çerçevelenir.
int ve xis proteinleri ne yapar?
int ve xis proteinleri, giriş vektörünün attL bölgelerini insert ile tanır ve hedef vektörün attR bölgesi ile rekombinasyonunu indükler.
proteinler hedef vektörde bulunan ccdB adlı bir genle değiştirir insert dnayı.
LR klonlama reaksiyonundan sonra neden giriş (entry) vektörünü taşıyan bakteriler ölür?
Çünkü LR reaksiyonundan sonra giriş vektörü ccdB içerir ve bu genin ürünü toksiktir.
BP klonlama reaksiyonu ne yapar?
İlgilenilen geni hedef vektörden çıkarır ve giriş vektörüne geri koyar.
Bu reaksiyon için int proteini, ilgilenilen geni çevreleyen attB bölgelerini tanır ve giriş vektörü üzerindeki attP bölgeleri ile rekombinasyonunu indükler.
Yapılar TRANSFORMASYON ile bakteriyel konakçı hücrelere aktarılır.
Doğru/yanlış?
Doğru
Elektroporasyon nedir?
Yapı ve bakteri iki elektrot arasındaki küvete konur. Elektrik akımı sayesinde bakterideki porların büyümesi ve geçiş sağlanır.
Raportör genler?
Ürünlerin tespit edilmesi kolay olduğu için kullanılan genler.
Genellikle gen ekspresyonunu rapor etmek/bildirmek için kullanılırlar
Yaygın bir raportör örneği?
beta-galaktosidazı kodlayan lacZ geni. Laktozu galaktoz ve glikoza ayırır.
