5 Flashcards
(19 cards)
proteinler nasıl tanımlanabilir?
immünolojik tarama ile.
protein ifade edildiğinde bir antikora bağlanarak tespit edilebilir.
proteinler nasıl tanımlanabilir? daha detaylı
bakteriler ana plaklarda büyütülür. her koloni uygun membrana aktarılır
hücreler parçalanır
primer, sekonder antikorlar.
bu ikincil antikorlar, alkalin fosfataz gibi saptama sistemini taşır
örn: X-phos kullanılırsa, sekonder antikorun bağlandığı membrandaki bölge maviye döner
cDNA kitaplığı ?
mRNA izole edilip kalıp olarak kullanılarak. karşı zincir sentezi için DNA pol kullanımı.
daha uzun ökaryot dizileri.
nükleik asitlerin floresanla tespiti?
farklı bazlar farklı floresan etkilere sahipse fotodedektör hangi bazın mevcut olduğunu belirleyebilir.
nükleik a. tespit yöntemleri?
*radyoaktif izotoplarla işaretleme
*floresanla
*biotin veya digoxigenin ile işaretleme
dioksigenin ile işaretlemede
raportör enzim olan alkalin fosfataz olayı?
x-phos alkalin fosfataz substratı olup bu enzim tarafından defosforile edildiğinde mavi renk alır
bioetin ve digoksigenin bağlandığı moleküller?
biotin streptavidine
digoksigenin ona özel spesifik antikora bağlanıyor.
fish floresan in situ hibridizasyonu?
*hücre, doku için hibridasyon
*ince doku kesitleri
*hedef dna tek iplikli hale getirilir
*beyaz kan hücreleri, kültürdeki hücreler
*yine floresan etiketli prob
*kromozomlarda gen konumunun belirlenmesi için
dot blot?
*hızlı ve kolay
*jel elektroforez aşaması yok (örnekler boyutlarına göre ayrılmamış yani)
protein etiketleme sistemleri?
Kısa a.a. dizileri ekleniyor.
6HIS, Myc, FLAG etiketleri
Histidinler nikele güçlü bağlanır. ya da imidazol de bağlanır.
Myc ve FLAG karşılık gelen antikora bağlanarak saflaştırılmasına izin veren epitoplardır.
Strep etiketine, avidin ve streptavidin bağlanır
pMAL vektörleri…
pMAL vektörleri, MBPmaltoz bağlayıcı protein füzyon proteinlerini oluşturmak için kullanılır.
Füzyon etiketleri olarak kullanılan tam uzunluktaki proteinler
Protein A (Staphylococcus’tan):
Antikorları bağlayabilir.
Bu yüzden, antikorları tespit etmek veya izole etmek için kullanılır.
GST (Schistosoma japonicum’dan):
Glutatyon adlı bir moleküle bağlanır.
Protein saflaştırmada etiket (tag) olarak kullanılır.
MBP (E. coli’den):
Maltoz ve amiloz gibi şeker moleküllerine bağlanır.
Yine saflaştırmada ve proteinlerin çözünürlüğünü artırmada etiket olarak kullanılır.
Intein etiketleri
kendi kendini kesebilen intein etiketleri
bir proteaz tanıma bölgesi kullanmak yerine, füzyon proteini, hedef proteinin saflaştırılmasında sonra kendi kendine kesim
DTT gibi tiyol reaktifleri tarafından düşük sıcaklıklarda tetiklenir
Kitin bağlanma alanı(CBD) bulunur
Fonksiyonlarına göre alt gruplara ayrılmış proteinler:
1eksik veya kusurlu proteinler için replasmanlar
2mevcut olan protein miktarını arttırmak
3bakteri veya virüs gibi bulaşıcı ajanların inhibasyonu
4diğer moleküller için taşıyıcılar
Gen klonlamayla protein üretiminde sınırlamalar?
1 ribozom bağlanma bölgesi, ribozom ile zayıf bir şekilde etkileşime girebilir veya hiç girmeyebilir
2mRNA kararsız olabilir veya güçlü bir sekonder yapıya sahip olabilir
3 klonlanmış gende yaygın olan kodonlar, bakteriyel konakçıda nadir olabilir.
insülin hormonunun öncülleri?
Preproinsülin: İlk sentezlenen, sinyal dizisi içeren form.
Proinsülin: Aktif olmayan, C-peptidini içeren form.
İnsülin: A ve B zincirlerinden oluşan aktif hormon.
farklı plazmitlerden üretilen A ve B formundaki insülinin polipeptitleri birleşti dimer oluşturdu. sonra bu dimerler birbiriyle bağlanma eğilimindedir ve hekzamer oluşumu gösterir.enjeksiyondan sonra hekzamerlerin ayrışması biraz zaman alır, bunun için çözüm?
insülin moleküllerinin birbirine değdiği yüzeyde bulunan B- zincirindeki bir prolin, yan zinciri negatif yük taşıyan bir aspartik asit ile değiştirilir. böylece hekzamer oluşumu gözlenmez (prolin olunca gözleniyordu)
hızlı etkili insülin tip 1 için daha iyidir. tip 2 için?
Lantus; sanofi-aventis
B zincirinin sonuna eklenen iki ekstra Arg sahiptir.
A zincirinde bir AspA21Gly değişimi
FISH floresan in situ hib. amacı?
Beyaz kan hücreleri, kültür hücreleri gibi örneklerde genetik konumları belirlemek ve kromozomlarda spesifik genlerin yerini saptamak.
