Metoder i genetik Flashcards
Hvad er metoden FISH god til at detektere
Balancerede translokationer Aneuplodi
Beskriv metoden FISH
Celler udtages fra f.eks. placentavæv Der udvælges en celle som er hvilende i metafasen Den fikseres på en slide og behandles sådan at den svulmer op Cellens DNA denatureres Der tilsættes prober som vil hydridiserer til specifikke områder i DNA Overskydende prober vaskes væk Modificerede flourescerende labels tilføres. Disse kan binde til DNA proberne. Resten af labels vaskes væk De flourserende molekyler vil lyse op, og afsløre genet/ kromosomer af interesse.
Beskriv metoden Array CGH
Der benyttes Control og Patient DNA med fluorescent Disses tilføres til en mikroarray Mikroarray består af 100 af spots, som hver indeholder en DNA sekvens som er specifik for et bestemt sted i genomet Array CGH sliden hydridiserer med fluroscerende DNA sekvenser fra patienten og fra kontrol De fluroscerende signaler fra sliden aflæses med en mircoarray scanner, og data analyseres. Alt efter intensiteten af farver udtrykt på sliden, kan man se hvilke DNA-sekvenser patienten enten udtrykker for meget af eller for lidt af
Hvad er metoden Array CGH god til
Undersøger ligeledes hele genomet for kvantitative ændringer (deletioner og amplifikationer) af en vis størrelse
Hvad er MLPA metoden god til at detektere
Til at undersøge for større deletioner eller duplikationer i et eller flere exons
Beskriv metoden
Denaturation: En prøve med DNA opvarmes i en thermocycler, hvorved DNA’et separeres. Hybridisation: Et probemix og probe-buffer tilføres til det separerede DNA. Prober/ oligonukleotider binder to og to til hvert af de analyserede fragmenter af DNA’et. Ligation: Der tilføres en ligationsmix til prøven. De to oligonukleotider/prober ligeres. Den samlede ligerede probe har 5’- og 3’-terminalt universalprimer- hybridiseringssites. Amplifikation (med PCR): PCR primere og d’NTPer tilføres. Universale PCR-primere hybridiseres hertil og der udføres PCR. En af primerne er flourescerende. Dette gøres 35 gange. Fragment separering: PCR-produkterne adskilles på længde vha. kapillær- elektroforese og man måler flourescens-intensiteten for hvert ”bånd”. Dataanalyse: Disse intensiteter kan herefter sammenlignes med tilsvarende
Beskriv i detaljer probemixen i MLPA
Hver probemix består af to stykker: En højre og venstre oligonukleotid Den venstre probe indeholder en stuffer sekvens. Stuffersekvenser varierer i længden af hver probe. Begge prober har hver deres 3-‘ og 5’-ende universalprimere hydribiseringsites
Beskriv amplifikation i MLPA
Der sker amplifikation med PCR. Der tilføjes primere, og d’NTPer. En af primerne er fluorescerende. PCR fortages 35 gange, hvor efter PCR-produkterne adskilles på længde vha. kapillær elektroforese. Man måler flourescens intensiteten for hvert bånd
Hvorfor består en MLPA probe af to (venstre og højre) oligonukleotider?
Hvis den var ligeret fra start, ville det kunne amplificeres, selvom der ikke var et korrekt DNA-match fra start. Når den består af to oligonukleotider, finder de hver sit passende DNA-segment.
Hvornår benytter man især NGS
Når man har en patient, hvorfra man ønsker næsten at undersøge hele genomet Eks. hvis der ikke er andre tilfælde i familien eller sygdommen er ukendt
Hvilke trin består splice assay af og hvad benyttes den til?
Bruges til at detektere exon skipping. Man benytter RNA fra syg patient og sammeligner med rask person Der fortages først reverse transcriptase på PCR. RT-PCR består af følgende trin Man oprenser RNA fra patient og der fortages cDNA syntese cDNA amplificeres via PCR PCR-produkterne adskilles på en kapillær elektroforese efter størrelse. Der sammenlignes med en rask patient.
Beskriv princippet i RT (reverse transcriptase) PCR
Man benytter RNA fra patient Der dannes cDNA cDNA amplificeres via evt. PCR eller Realtime PCR (mængden af PCR-produkt måles enten via fluorescens). Ved normal PCR adskilles PCR-produkterne via en gel og er et udtryk for mængden af RNA i ens prøve
Definere læsedybe
Antal reads som dækker et genomisk område (overlap af dannede DNA-sekvenser)
Hvad kan f.eks. ikke ses med array CGH
balancerede translokationer
Der fortaget en slice
