Altfragen Proteine quantifizieren Flashcards
(30 cards)
Was benötigt man zur Proteinbestimmung?
- Probelösung, Standardlösung, Reagens
- Photometer, Küvetten, Eporuvetten
- Reagientienleerwert (Blank)
Welche Methoden gibt es, um Proteine zu messen?
- UV-Absorption
- Biuret-Methode
- Lowry-Methode
- Bradford-Methode
- BCA-Methode
- Albuminbestimmung
Warum gibt es mehrere Messmethoden zur Proteinbestimmung?
- Methoden liefern abweichende Ergebnisse aufgrund unterschiedlichem Verhalten der Proteine
- Störsubstanzen im Protein befinden (z.B. Tenside, Reduktionsmittel)
Was bedeutet quantitative Proteinbestimmung?
man misst, wie viel Protein in einer Probe enthalten ist
Warum wird bei der Messung von Proteinen auch das Gesamtprotein gemessen?
um eine Normierung durchführen und Messwerte vergleichbar machen zu können
Warum kann bei der UV-Methode aufgrund der Absorption auf die Proteinkonzentration geschlossen werden?
da zwischen Extinktion und Stoffmengenkonzentration ein linearer Zusammenhang besteht (Extinktion ist direkt proportional zur Konzentration)
Warum funktioniert die UV- Absorptionsmethode und welche Schwierigkeiten gibt es?
Funktionsweise: Messung der Eigenabsorption im UV-Bereich (280 nm) von aromatischen Aminosäuren
Schwierigkeiten:
- eingeschränkte Anwendbarkeit
- Lösungen müssen klar und sauber sein
- Störung von Stoffen, die selbst eine Eigenabsorption im UV-Bereich besitzen
- abweichende Werte durch unterschiedlich hohen Gehalt an aromatischen Aminosäuren
Welche Aminosäuren werden im UV-Bereich/ bei 280 nm absorbiert?
aromatische Aminosäuren: Phenylalanin, Tyrosin, Tryptophan
Bei welchen Methoden spielen Kupferkomplexe eine Rolle?
Biuret-Methode, Lowry-Methode, BCA-Methode
Welche Rolle haben Kupferionen bei der Proteinmessung?
bilden Komplexe mit Peptidbindungen
Beschreibe das Prinzip der Biuret Methode!
beruht auf Komplexbildung von Cu2+ - Ionen
- mindestens 2 Peptidbindungen erforderlich
- fotometrische Messung bei Wellenlänge von 540 nm
- Farbintensität = proportional der Anzahl der Peptidbindungen/Proteinkonzentration
Was ist eine Peptidbindung?
= Bindung zwischen der Aminogruppe und der Carboxylgruppe in einem Peptid bzw. Protein
- entsteht im Rahmen einer Kondensationsreaktion zweier Aminosäuren unter Abspaltung von Wasser
Wie werden Peptidbindungen noch genannt?
Säureamidbindung
Beschreibe das Prinzip der Lowry Methode!
beruht auf Komplexbildung von Cu2+ - Ionen und einer anschließenden Reaktion
- Reduktion eines Folin-Reagens durch Kupferkomplex
(Farbänderung von gelb zu blau)
- Reduktion des Folin-Reagens auch ohne Kupferkomplex durch Aminosäuren Tyrosin, Tryptophan oder Cystein
Welche Substanzen bei Lowry reduziert?
- zweiwertige Kupferionen werden durch die Peptidbindung zu einwertigen Kupferionen reduziert
- Protein-Cu+-Komplex wiederum reduziert die Folin-Reagens zu Molybdänblau
Beschreibe das Prinzip der BCA Methode!
beruht auf Komplexbildung von Cu2+ - Ionen und einer anschließenden Umkomplexierung
- aus Proteinkomplex wird Bichinolindicarbonsäure
Warum stören Reduktionsmittel die Probelösung bei der BCA-Methode?
da bei der Methode eine Reduktionsreaktion beteiligt ist, ist sie empfindlich auf sonstige Reduktionsmittel in der Probelösung
-> Reduktionsmittel reduzieren die zweiwertigen Kupferionen zusätzlich und dadurch werden die
Ergebnisse verfälscht
Wie funktioniert die Farbreaktion von grün auf violett bei der BCA Methode?
Umkomplexierung des Protein-Kupferkomplexes zu einem blau-violetten Komplex mit der Reagens BCA
Was ist der Unterschied zwischen der Lowry-Methode und der BCA-Methode?
- Lowry-Methode: Reagens = Folin-Reagens, die vom
Protein-Kupferkomplex reduziert wird, wodurch es zu einer Farbänderung von gelb nach blau kommt - BCA-Methode: Reagens = Bichinolindicarbonsäure aus dem Protein-Kupferkomplex entsteht ein Komplex mit der Reagens, der eine blau-violette Färbung hervorruft
Beschreibe das Prinzip der Bradford Methode!
beruht auf unspezifischer Bindung eines Farbstoffes (Coomassie Brilliant Blue) an Proteine
- Änderung des Absorptionsverhaltens
Welche Gruppe von Aminosäuren binden den Farbstoff Coomassie Brillant Blue?
v.a. basische und unpolare Aminosäuren
Nenne 3 basische Aminosäuren!
Histidin, Lysin, Arginin
Was ist der Unterschied zwischen der Bradford-Methode und der spez. Albuminquantifizierung?
bei der Albuminquantifizierung bindet der verwendete Farbstoff (häufig Bromkresolgrün) spezifisch an Albumin, während Coomassie Brillant Blue
unspezifisch an Proteine bindet
Was sind die Schwierigkeiten bei der Proteinbestimmung?
- Mischungen aus verschiedenen Proteinen bei biologischen Proben -> unterschiedliches Verhalten bei Quantifizierung
- Störung durch andere Stoffe (z.B. Tenside, Reduktionsmittel)
- keine Endpunktmessungen, d.h. Reaktion kommt nach Inkubationszeit nicht zum Stillstand
(Einhalten der Reaktionszeit wichtig)
