BCM TP Cours 1

Question 1

Première étape de la méthode de solubilisation? (purification des protéine)

Answer 1

Dissoudre dans une phase liquide les protéines

Question 2

Méthode la plus douce et simple pour killla cell contenant des protéines ?

Answer 2

La lyse osmotique

cellules dans solution hypotonique-→ provoque éclatement de la cellule (+ efficace pour cellule animale car pas de paroi)

pour les parois, utilisation de lysozyme

Question 3

Avant d’isoler la protéine d’intérêt les tissus exigent une désintégration mécanique pour accéder à leur contenu. Quelles sont les méthodes?

Answer 3

Broyage avec du sable, Déchiquetage mécanique (blender), Homogénéisateur, Rupture par haute pression, Sonification.

une fois cellule brisée, le lysat peut être filtré pour obtenir protéine d’intérêt

Question 4

Comment savoir si un lysat a bien été segmenté/filtré?

Answer 4

En utilisant un marqueur moléculaire (montre si bien isolé)

Question 5

La protéine doit rester stable, ce qui tient compte de +sieurs facteurs, que sont ils?

Answer 5

pH : utilisation de solution tampon qui garde le pH → 6,5-7,5/8

Température : doit rester à base température 0-5 degré, se dénature à 25 degré

Protéases : peuvent dégrader protéine lors de purification, ajout d’inhibiteurs de protéase peut empêcher dégradation.

Question 6

Protéine purifiées par des méthodes de fractionnement, Utilisation des différentes propriétés physico-chimiques :

Answer 6

solubilité

charge ionique

taille moléculaire

propriétés d’adsorption et liaison à d’autres mols

Question 7

approche couramment utilisé pour purifier une ou des protéines (diminuer sélectivement:

Answer 7

Les précipiter

Question 8

La solubilité d’une protéine dépend :

Answer 8

des interactions polaire avec le solvant aqueux

interactions ioniques avec les sels en solution

forces électrostatique répulsives entre mols ou agrégats de charge similaire

Question 9

Qu’exige la précipitation ?

Answer 9

La formation d’agrégats de protéine

Question 10

Variation utilisé pour diminuer solubilité d’une prots

Answer 10

force ionique (concentration saline)

pH

ajout de solvant organiques

ajout de polymère inertes

(on peut favoriser la précipitation avec ces facteurs)

Question 11

Qu’est-ce que le salting in?

Answer 11

À la zone de force ionique de 0 - 0,5M, augmentation en solubilité avec une concentration croissante en sels. (défavorise l’isolement de la protéine)

Question 11

Pourquoi le salting in défavorise la formation de l’agrégat (défavorise isolement)

Answer 11

Car les sels lient directement les protéines et augmente leur charge nette, favorise solubilité :

les sels augmentent interactions avec l’eau

augmentent la répulsion entre protéine (diminue agrégation)

Question 12

Quand est-ce que le salting in peut être utile?

Answer 12

pendant la purification, lorsqu’on veut dessaler (SALTING OUT) la protéine par dialyse (dialyse contre un tampon de faible force ionique peut provoquer précipitation des protéines)

Question 13

Qu’est-ce que le salting out? (Déssalage)

Answer 13

technique utilisé pour purifier des protéines (hautes concentrations de sel)-→ compétions entre les ions salins ajoutés et les prots pour la solvatation (accès au molécule d’eau)

Question 14

Pourquoi le salting out favorise les précipitations?

Answer 14

compétition entre ions salins et protéine pour avoir accès aux molécules d’eau, résultat : diminution de la solvatation des protéines, les protéines auront moins de surface solvatée, ce qui favorisera leur agrégation.

FONCTION DE L’HYDROPHOBICITÉ DE LA PROTS, LES RÉGIONS HYDROPHOBES SERONT LES PREMIÈRES À ÊTRE - BIEN SOLVATÉES.

Question 15

Qu’est-ce qui favorise la précipitation des protéines? Haute ou basse concentration de sel

Answer 15

Une haute concentration de sels

Question 16

RÉSUMÉ DESSALAGE (salting out)

Answer 16

• une agrégation protéique qui implique des régions hydrophobes sur la surface d’une protéine.

au fur et à mesure que les ions de sels deviennent solvatés, les molécules d’eau libres deviennent peu nombreuses.

Il y aura une plus grande tendance pour la protéine de perdre des molécules d’eau autour des résidus hydrophobes

ce qui favorise l’agrégation, puisque les régions hydrophobes exposées ont une préférence à interagir entre elles plutôt qu’avec de l’eau

Question 17

Sorte de sel qui se lie et interagit directement avec la protéine et qui peut avoir un effet déstabilisant

Answer 17

Chaotropique

Question 18

Sorte de sel qui encourage hydratation des régions polaires et la déshydratation des régions hydrophobes chez une protéine sans intéragir avec la protéine

Answer 18

sels optimaux

Question 19

La série Hofmeister

Answer 19

sulfate d’ammnium (N4)2SO4 est le sel le plus utilisé en précipitation

Question 20

Que fait l’addition d’un solvant msicible avec l’eau comme l’éthanol ou l’acétone?

Answer 20

Ça diminue la solubilité des protéines

Question 20

Résumé salting in

Answer 20

augmentation de la solubilité d’une protéine dans l’eau par l’ajout de faibles concentrations de sels

les ions salins interagissent directement avec les protéines

• les ions de même charge augmentent la répulsion entre protéines, ce qui réduit leur agrégation ® favorise leur solubilité
• ces ions (qui sont hydrophiles) augmentent les interactions des protéines avec le solvant aqueux ® favorise leur solubilité

Question 21

Résumé salting out

Answer 21

:diminution de la solubilité d’une protéine dans l’eau par l’ajout de hautes concentrations de sels.

• les ions salins n’interagissent pas avec les protéines

l’ajout de hautes concentrations de sels très hydrophiles amène la séquestration des molécules d’eau par ces ions

• la quantité de molécules d’eau disponible pour solubiliser les protéines diminue
• les régions hydrophobes des protéines seront déshydratées en premier lieu ce qui favorisera le rapprochement des régions hydrophobes des protéines (via interactions hydrophobe ->effet goutte d’huile)

Question 22

Tendance à une protéine au pH isoélectrique?

Answer 22

Tendance à devenir moins soluble, car charge globale nette près de 0 minimise la répulsion électrostatique, attirance entre les molécules→ agrégation→ précipitation (se nomme précipitation isoélectrique)

Question 23

Qu’arrive t-il à l’eau lorsqu’on ajout solv org?

Answer 23

réduit pouvoir de l’eau de solubiliser une macromolécule chargée , à cause d’une réduction de la constante diélectrique de l’eau (pouvoir solvatation)

Question 24

facteur qui détermine solubilité dans un solvant aqueux/org?

Answer 24

Taille de la protéine : + grande est la prots, + basse est la concentration en solvant organique nécessaire pour précipiter, car surface + grande, donc meilleur chance d’avoir une région chargée complémentaire avec une autre protéine.

Question 25

Propriété physico-chimique : solubilité , quelle technique utilisée?

Answer 25

précipitation

Question 26

Propriété physico-chimique : charge ionique, quelle technique utilisée?

Answer 26

• chromatographie par échange d’ions
• électrophorèse
• focalisation isoélectrique

Question 27

Propriété physico-chimique : taille moléculaire, quelle technique utilisée

Answer 27

• ultracentrifugation
• chromatographie par gel-filtration
• électrophorèse

Question 28

Propriété physico-chimique :spécificité, quelle technique utiliser?

Answer 28

• chromatographie d’affinité