Bioch : ADN recombinant 3 Flashcards
10/09/24 => Le Pabic cours n°3 (34 cards)
Définition des cosmides ?
Vecteur artificiel constitués d’un plasmide classique auquel on a ajouté les séqu d’un phage lambda
Origines des vecteurs ?
Origine naturelle ++ comme plasmides et bactériophages, mais ont été largement modifiés
Quelles sont les propriétés attribuées aux vecteurs ?
- Capacité de réplication autonome dans une cellule hôte donnée
- Possession d’un site de clonage multiple = MCS (insertion du fragment d’ADN) → sites uniques de restriction → sites de digestion enzymatique sur le vecteur → là où il peut être ouvert
- Insertion d’un fragment d’ADN
- Présence d’un marqueur de sélection → permet d’identifier la bactérie contenant notre protéine recombinante
Définition des plasmides ?
Petites molécules d’ADN double brin extra Xsomique circulaire de 3 à 10 kb, capable de se répliquer indépendamment du Xsome bactérien et pouvant être transféré d’une cellule à l’autre
Quelles sont les zones qui composent un plasmide ?
- Origine de réplication (Ori) dans la bactérie
- Marqueur de sélection
- Site de clonage multiple
- Promoteur
- Codon stop
Caractéristiques des marqueurs de sélection ?
Nbx sites de restriction uniques dans tout le plasmide permettant l’insertion du fragment de l’ADN d’intérêt après de le promoteur
Caractéristiques du promoteur dans les plasmides ?
Exprime la protéine d’intérêt => besoin de cloner la seq d’ADN en phase avec le promoteur
Définition des enzymes de restriction ?
- Endonucléases
- Coupe un fragment d’ADN 2BLE brin dans le sens 5’→3’
- Agissent au niveau d’une seq de nucléotides caractéristiques : dite de restriction
Rôles des enzymes de restriction chez les bactéries ?
Permettent de couper et détruire l’ADN étranger (ex viral)
Comment la bactérie se protège-t-elle des enzymes de restriction ?
Par des modification de l’ADN de type méthylation
Nomenclature des enzymes de restriction ?
- Première lettre (majuscule) : genre bactérien
- 2ème/3ème : espèce de bactérie
- Lettre majuscule à la fin : souche bactérienne ou a été trouvée l’enzyme
- Chiffre romain : numéro d’ordre de découverte dans une même bactérie
Quels sont les types de coupures réalisées par les enzymes de restriction ?
2 :
* Cohésive (sticky)
* Franche (blunt) au niveau d’un site palindromique
Quel est le principe de l’insertion de l’ADN d’intérêt dans le vecteur ?
- Digestion 1 heure dans un tampon adapté et à T° optimale de l’enzyme
- Digestion par les enzymes 1 et 2 → Création de 2 extrémités cohésives → Libération d’un petit bout d’ADN lors de l’ouverture du plasmide
Quels sont les risques si l’on ouvre le plasmides avec deux enzymes identiques ?
On obtient des bouts collants → 2 extrémités cohésives (ou franches) complémentaires avec les extrémités du vecteur plasmide → Plasmide risque de se refermer sur lui-même
Comment éviter la réinsertion du fragment d’intérêt lors d’utilisation de deux enzymes de restriction identiques ?
Il est nécessaire de séparer les 2 (plasmides et ADN) produits de la digestion du vecteur et de purifier le vecteur digéré pour la suite du
clonage
Comment éviter la fermeture du vecteur lors d’utilisation de deux enzymes de restriction identiques ?
Utiliser une phosphatase alcaline qui permet d’enlever le phosphate en 5’ du vecteur
Quel est intérêt d’utiliser deux enzymes différentes lors de la digestion pour l’ouverture du vecteur ?
Permet une insertion orientée de l’ADN à cloner dans le vecteur et limite la religation du vecteur sur lui-même
Quelle méthode est utilisée pour la purification du vecteur digéré ?
électrophorèse
Définition de l’électrophorèse ?
Méthode de séparation de particules chargées électriquement par migration différentielle sous l’action d’un champ électrique
De quoi dépend la migration de l’échantillon sur l’électrophorèse ?
=> De la charge et de la géométrie des particules
- Les fragments d’ADN (chargés - grâce au phosphate) migrent de façon inversement proportionnelle à la taille
Quel est le matériel utilisé pour réaliser l’électrophorèse ?
Gel d’agarose et solution d’électrolyte qui recouvre le gel
Méthode de réalisation de l’électrophorèse ?
- Dépôt d’échantillons dans les puits du gel. Les échantillons sont supplémentés d’un
bleu de dépôt (tampon) pour pouvoir visualiser l’évolution de la migration - Par le champ électrique, migration des fragments d’ADN et séparation en fonction de leur taille et de la géométrie
- Révélation du gel avec du bromure d’éthidium (BET= intercalent fluorescent de l’ADN) → s’intercale entre les bases de l’ADN et il permet de voir les fragments d’ADN sous UV (produit cancérigène)
- Obtention de 2 bandes = vecteur digéré et petit fragment extrait du vecteur
- Utilisation marqueur de PM avec des fragments d’ADN de taille connue → permet de déterminer la taille des bandes d’intérêt par comparaison au marqueur
- Récupération de la bande d’intérêt (ex vecteur) : purifie sur une colonne (fixation de l’ADN sur la colonne, lavage, puis élution
de l’ADN purifié) → on récupère ainsi l’ADN du vecteur digéré, utilisé pour le clonage + permet aussi d’éliminer en partie les traces de vecteur non digéré
Comment se fait la ligation du fragment d’ADN d’intérêt dans le vecteur ?
On a créé des extrémités collantes/cohésives complémentaires → insertion du fragment d’ADN dans le vecteur qu’on a ouvert et purifié → hybridation au niveau des extrémités covalentes
→ Utilisation ligase → va réaliser des liaisons phosphodiesters (covalentes) entre 2 molécules d’ADN
=> on obtient un plasmide recombiné
Comment se fait la transformation des bactérie (ou transfection des cellules euca) ?
1) Mélange de plasmides et de bactéries compétentes sur glace
2) Il y a 2 méthodes :
● Choc thermique : bain marie entre 37° et 42° pendant 30 sec à 1 min puis on le remet
sur la glace
● Électroporation : création d’un arc électrique sur la membrane de la bactérie ⇒ pour que les plasmides pénètrent dans les bactéries
→ 2 techniques permettent de faire des pores transitoires dans la membrane de la bactérie et faciliter l’entrée des plasmides
3) Ajout de milieu nutritif aux bactéries, et croissance pendant 1 heure à 37°C pour permettre l’expression des protéines de résistances aux antibiotiques pour la sélection ultérieure
