Ch 7.2 Flashcards
(56 cards)
Que permet le clonage moléculaire?
- d’amplifier et de conserver un fragment d’ADN (banques / librairies d’ADN)
- d’exprimer une séquence d’ADN d’intérêt
- d’introduire un gène dans une cellule ou un organisme
- de produire une protéine d’intérêt (protéine recombinante)
Nommer les 3 types de banques d’ADN et leur définition
1-Banque génomique: Banque couvrant l’ensemble du génome.
2-Banque d’ADN complémentaire ou ADNc: Banque constituée d’ADNc, qui ne représentent pas nécessairement la totalité des ARNm. Il s’agit plutôt d’une banque fabriquée à partir uniquement des régions transcrites du génome.
3-Banque d’expression: Banque dans laquelle le vecteur porte des signaux
transcriptionnels permettant à n’importe quel insert cloné de produire un ARNm et en dernier lieu, une protéine.
Quels sont les vecteurs avec lesquels ont fait des banques?
Chromosome artificiel bactérieur (BAC)
Quelles ont les étapes pour former une banque de BACs?
1) Mélange et ligation
2) Transformation par des bactérie
3) Étalement sur boîte de Pétri sur milieu sélectif-
4) Tri de colonies blanches par Q-blot
La démarche est-elle différente si digestion incomplète des inserts par enzyme de restiction ou vesteur linéarisé par la même enzyme de restriction ? pour banque?
OUI
Faut-il autant de molécules recombinantes pour avoir une bonne probabilité de trouver un gène donné? E. Coli vs Homo sapiens
Non! dépend de la taille du génôme! - Humain : 3G bp donc N=6,9x10^5 recombinants - E. Coli : 4,6M bp N=1,1x10^3 recombinants
Pourquoi souhaite-on étudier exprimer l’expression d’une séquence d’ADN d’intérêt comme un gène (via clonage)?
A. pour étudier son expression (séquences régulatrices comme les promoteurs)
B. Pour produire une protéine d’intérêt (protéine recombinante)
Donner un exemple de l’usage du clonage pour étudier séquences régulatrices comme les promoteurs.
Lac Z: pour l’activité B-galactosidas)
Identification de la zone promoteur minimal (-10 à - 50)
Expliquer pourquoi les cellules d’E. Coli utilisées dans les fermenteurs de production de protéines à l’échelle industrielle meurent). Expliquer comment contourner ce problème
- avec un fort taux de CROISSANCE et une synthèse très importante des protéines recombinantes, les cellules meurent rapidement, ce qui limite alors l’expression des protéines recombinantes
- Pour résoudre ce problème : DÉCOUPLAGE entre une phase de croissance (multiplication des bactéries, et donc amplification du gène de la protéine d’intérêt) et une phase d’expression (transcription du gène qui conduira à la synthèse de la protéine)
Expliquer comment on peut utiliser l’opéron lactose pour le clonage?
1) remplacement du gène LacZ par la séquence du gène de la protéine d’intérêt.
2) ITPG, analogue du lactose = se lie au répresseur , l’emêche de se fixer à opéron
3) Activation de la transcprition
4) Protéine recombinante
Comment récupère-t-on les protéines recombinante après leur synthèse?
prots dans cytoplasme bactérie qui a MB
- Sonification : Destruciton mécanique par des ultrasons
- Ajout de détergent (Lyse chimique)
Comment analyse-t-on protéines recombinantes?
- Électrophorèse sur gel polycrylamide
- Western blot après transfert sur membrane
Pourquoi est-il souvent nécessaire de travailler avec cellule eucaryote pour exprmier une séquence d’ADN d’intérêt?
IL ARRIVE QUE
1) La bactérie n’est pas capable d’exprimer un gène eucaryote
2) La bactérie n’est pas capable de fabriquer une protéine eucaryote fonctionnelle (modifications chimiques, repliement …)
Comment appelle-t-on l’équivalent eucaryote de la transformation bactérienne?
Transfection eucaryote
Expliquer la différence entre transfection stable et transitoire
1) Transitoire : l’ADN introduit n’est pas habituellement introduit dans le génome nucléaire: il sera donc perdu au cours de la mitose
2) Stable : l’ADN introduit est intégré au génome et dans ce cas, ce fragment d’ADN va rester présent dans les cellules au cours des division cellulaires
Quel agent est généralement utilisé pour évaluer si pour évaluer la résistance à toxine?
généticine est une toxine neutralisée par le gène de résistance à la néomycine
Quel mécanisme de clonage est à la base de la production d’animaux transgénique?
Transfection eucaryote
Quels sont les critères pour choisir un organisme comme modèle?
1) Vivre en labo et se reproduire (pas trop contraignant : alimentation et influences ext)
2) recherches préalables en dehors génie génétique
3) Reproduction rapide (pour diminuer durée expérience)
4) Modifiable par génie génétique
Donner des exemples et contre-exemples de modèles
Éléphant : massif, nourriture, gestation lente (22mois)
Souris : petite, reproduction rapide.
Nommer les espèces modèles
1) Caernorrhabditis elegans : Ver nématome
2) Mouche du vinaigre (Drosophilia melanogaster)
3) Poission zèbre
4) Souris commune (Mus musculus)
Quels sont les intérêts d’utiliser des organismes différents?
1) étudier détail particulier
2) Plus un être vivant est proche d’un autre, plus résutats exp. pourront être transférés (ex.: souris—-homme > ver—-homme
99%) car H et souris 99% matériel génétique commun
Quels sont les modèles animaux les plus précieux?
exploration maladies de l’individu
Caractéristiques de la myodystrophie de Duchenne
1) Maladie héréditaire : atrphie musculaie dès très jeune âge
2) gène codant dystrophine sur chromosome X
(Dystrophine joue rôle formation protéines musculaires)
Quelles sont les trois méthodes pour faire des animaux transgéniques?
1) Knock-out : Inactiver un gène ou partie de gène sélectionné
2) Knock in : modifié gène puis l’introduire dans génome de l’organisme modèle (par recombinaison homologue
3) Transgenèse additive : addition d’une séquence d’ADN dans le génôme avec une intégration au hasard. Expression de ce ou ces gènes chez animal hôte
