Classe 1 Flashcards
(41 cards)
Le projet HUGO
(Human Genome Organisation)
—> a identifié et séquencé tous les gènes humains (2003) et il a permis l’identification de d’innombrables mutations néfastes
Gènes dans le génome (#?)
20 - 25 000 gènes
(mais l’épissage alternatif permet la synthèse de beaucoup plus de
25 000 protéines)
Applications de techniques de Biologie Moléculaire:
- Génétique
- Dx (Dx pré natal aussi) - Oncologie
- identifier les porteurs de certaines mutations prédisposant aux cancers
-modulation du traitement par rapport aux mutations tumorales - Microbiologie
-identifier organismes (bactéries, mycobactéries) avec technique de PCR
- PCR peut même identifier leurs gènes de résistance aux antibiotiques - Médecine légale
- recherche des RFLPs
(incriminer ou d’éliminer avec une certitude presque absolue un suspect, avec un cheveu, une goutte de sang ou de sperme)
(résoudre les cas où la paternité est en jeu)
deux types généraux de modalités diagnostiques moléculaires
1) évaluent l’ADN
—> évaluent si un gène est présent ou non, et s’il est muté
2) évaluent l’ARN
—> information sur la transcription de ce gène (ce gène est actif ou non dans un tissu ou dans une cellule)
Les tests d’ADN
Southern,
le PCR,
la FISH,
le CGH
le SNP
tests qui évaluent la transcription (i.e., l’expression génique)
le Northern,
le RT-PCR,
les puces évaluant l’ARN,
le buvardage de Western
Solubilité dans le chloroforme/phénol
L’ADN —> pas soluble
Les protéines et les membranes cellulaires,+ les autres composantes cellulaires —> très solubles
(l’eau n’est pas miscible avec le mélange chloroforme/ phénol, et l’ADN est très soluble dans l’eau)
ADN génomique
contient les introns
les exons géniques,
+ les séquences non-codantes
Enzymes de restriction:
enzymes que reconnaissent une séquence de paire de bases (pb) de façon très précise,
—> ne coupe que cette séquence
—> différence d’un seul nucléotide empêche l’action de ces enzymes
—> une mutation qui induit ou supprime un site de restriction peut facilement être mise en évidence
EcoR1
Enzyme de restriction qui reconnaît GAATTC (un palindrome)
—> donne extrémités cohésives (collantes) : on peut recoller 2 fragments différents si ils ont tous deux été coupés par EcoR1
Fréquence des coupures par les enzymes de restriction
Technique de Southern: méthode
1) digestion par Enzymes de Restriction de l’ADN purifié
—>chaque fragments : longueur différente = chaque fragments aura un poids moléculaire et une charge différente
2) electrophorese sur gel d’agarose
—> pour séparer les fragments de restriction suivant leur longueur,
+ grands = moins mobiles,
+ petits = migrent le plus loin
(Visualisation avec BrET + UV)
3) Transfert de l’ADN sur une membrane
(nylon ou en nitrocellulose)
4) hybridation avec sondes complémentaires à la séquence recherchée à l’ADN dénaturé
(segments d’ADN marqués radioactivement ou enzymatiquement)
5) Identification des séquences d’intérêt avec film radiographique
—> on peut manipuler les conditions d’hybridation afin de favoriser la stringence (conditions ne permettant qu’une hybridation parfaite) ou la permissivité
Southern utilisations
1) détecter la présence de micro-organismes dans un échantillon: on utilise une ou des sondes spécifiques
2) détecter des allèles mutés de poids moléculaire différent de l’allèle “normal” (RFLP)
3) évaluer la quantité d’ADN présent dans l’échantillon
southern quantitatif
4) détecter des allèles mutés lorsque cette mutation induit ou supprime un site de restriction
5) déceler des mutations ponctuelle
ASO
Inconvénients southern
1) ++manip. = $$$$
2) étapes longues = pas de Dx rapide
3) besoin de grandes quantités d’ADN
(pour hybrider suffisamment de sonde pour avoir un signal décelable)
technique des ASO
(Allele Specific Oligonucleotide)
1) étudie les sondes ASO:
expériences pour déterminer la température pour laquelle les brins parfaitement homologues se dénaturent (sonde ASO / ADN génomique)
2) prend notre sonde et on l’hybride avec l’ADN à étudier (conditions stringentes)
3) chauffe la solution à une température très légèrement inférieure à la température de fusion (dissociation)
—> sonde reste hybridée = homologie parfaite
—> sinon (pas de signal)= différence d’au moins un nucléotide entre la sonde et l’ADN génomique
Southern- RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) méthode & utilisation
“polymorphisme de longueur des fragments digérés”
—> utilisée pour différencier les allèles d’un gène qui nous intéresse (test paternité, identification génotype)
—> avec plus de sondes: permet d’incriminer ou d’éliminer un suspect en comparant son ADN à celui qui fut retrouvé (sur victime ou au crime)
• Sondes connues comme reconnaissant des séquences très polymorphes (en taille)
• Statistiquement, deux
individus ne peuvent
avoir les mêmes longueurs d’allèles pour toutes ces séquences
Comment:
1) southern (isolation ADN, clivage par enz. de restriction, electrophorese, passage à membrane)
2) hybridation avec plusieurs sondes pour déterminer longueurs différentes des allèles
allèle: fragments d’ADN sur lesquels sont situés les gènes qui nous intéressent (“fragments de restriction”)
—> peuvent être de taille variable
—> segment d’ADN du gène entre la boîte TATA et le codon Stop est de même longueur sur tous les fragments
2 raisons qui expliquent les différences de taille entre les fragments de restriction
1) portion incluse entre les sites de restriction peut contenir des séquences répétées à différent #
(Alu, LINE, SINE, (CA)n, microsatellites)
2) différence d’un seul nucléotide peut générer ou oblitérer un site de restriction = fragment d’ADN plus court ou plus long
(polymorphismes au niveau de l’ADN non codant ou dans une séquence codante)
—> ex. Drepanocytose (mutation ponctuelle du codon GAG—>GTG au niveau de la séquence codante du gène de l’hémoglobine)
Hybridation sur tache:DotBlot
technique d’hybridation autre que le Southern bcp + rapide que Southern=pas digestion, electrophorese et transfert sur membrane
Méthode
1) ajoute directement une goutte de la solution d’ADN non digéré (ou le produit d’amplification par PCR) sur une membrane
—> 100 à 10 000 échantillons par membrane
2) hybridation avec la sonde d’intérêt
3) révéler sonde
—>favorisée pour:
A- évaluer un grand # d’échantillons rapidement pour la présence ou l’absence d’un gène (criblage de population),
B- quand taille du fragment d’ADN détecté n’est pas importante (lorsqu’on cherche une réponse « oui/non »)
Technique de Northern:
Comme southern pour ARN
etudie transcrits des gènes
1) extrait l’ARN des cellules
—> pas de digestion: il est déjà de petite taille
2) migrer par électrophorèse
3) transférer sur une membrane
4) hybride avec des sondes d’ADN ou d’ARN complémentaires marquées
5) révèle le signal
Technique de Western
étudie les protéines
1) Électrophorèse des protéines dans un gel SDS-PAGE
2) Transfert du gel vers la membrane
3) Visualisation des protéines avec anticorps (Immunodétection)
—> immunohistochimie permet de voir localisation de la protéine mais pas les isoformes et des polymorphismes d’une protéine
PCR (Polymerase Chain Reaction) classique
1) ADN d’une ou + cellules —> suspension dans une solution contenant les amorces(à excès), des nucléotides et de la polymérase
2) dénature ADN (95C)
3) hybride amorces (60C)
4) permettre à la polymérase de synthétiser les nouveaux brins d’ADN (72C)
5) plusieurs cycles répétés
6)analyse
- electrophorese (afin de voir si il y a eu amplification ou non)
—> si taille du fragment recherché est la = présent dans l’échantillon
—> peut faire hybridation avec sonde via Southern pour 2ble vérification
La polymérase ne fonctionne qu’en 5’ 3’
PCR modifications
1) Q-PCR (PCR Quantitatif)
identifier # de copies d’un gène (C-MYC)
identifier charge virale des patients infectés (VIH, EBV, Hépatite)
Amplification avec des nucléotides marqués par des fluorochromes
—> fluorescence est quantifiée pendant chaque cycle d’amplification de PCR-Real-Time
—> # de copies présentes dans l’échantillon est déterminée par le # de cycles d’amplification requis pour générer 2,4 u de fluorescence
3 phases:
1) phase de latence (exponentielle, sous seuil de détection)
2) exponentielle
3) plateau
2) RT-PCR
-isole ARNm —> cDNA (contient que les exons)
par transcriptase inverse
-continue PCR
Avantages et inconvénients PCR
Avantages:
- Dx en quelques heures
- nécessite de très petites quantités d’ADN
- peut faire 96 tests à la fois
- nécessite pas ADN purifié (** southern oui**)
- pas cher
Inconvénients :
- ne peut être faite que si les amorces nécessaires sont connues (séquence du gène est connue)
- limite de taille (ne peut amplifier des séquences de plus de quelques milliers de pb) - RT-PCR peut être solution
Techniques utilisées pour visualiser les chromosomes
Caryotype
FISH – Fluorescent in situ hybridization CGH – Comparative genomic hybridization
(sur chromosomes & sur puces)
SNP – Single nucleotide polymorphisms Puces conçues pour Ddx clinique
Puces combinées CGH-SNP
