Cours 10 - Microscopie (complet) Flashcards
Définir grossissement et résolution
Grossissement : importance de l’agrandissement de l’objet par le microscope
Résolution : plus petite distance entre deux points pouvant être différenciés par le microscope, qualité ou netteté de l’image
Donner l’équation de la résolution, définir toutes les variables et identifier les relations
r = 1.22*(lambda/2ON)
r : résolution
lambda : longueur d’onde d’illumination de l’objet
ON : ouverture numérique du microscope (capacité du microscope à collecter lumière)
- Résolution proportionnelle à longueur d’onde (plus lambda petit = meilleure résolution)
- Résolution inversement proportionnelle à ouverture numérique (plus ON grand = meilleur résolution)
Vrai/Faux : les plus petites longueurs d’ondes ont moins d’énergie
Faux, elles en ont plus
Donner l’équation de l’ouverture numérique (ON), et définir les variables
ON = n*sin(alpha)
n : indice de réfraction du milieu optique
alpha : angle d’entrée de la lumière de l’objectif
Donner deux limitations en rapport avec les variables de l’équation de la résolution, et la solution
1) Longueur d’onde la plus petite dans spectre visuel est 400nm
2) ON la plus élevée des objectifs est autours de 1
Cela donne une résolution d’environ 244nm, pour augmenter résolution il faut utiliser des longueurs d’ondes de plus haute énergie que le spectre visible (ex. UV, faisceau d’électrons)
Comparer la formation de l’image dans un microscope simple vs composé
Simple : 1 seule lentille (ex. loupe), réfraction dans un plan focal qui permet une magnification limitée
Composé : 2 lentilles ou plus (objectif et oculaire), permet un grossissement bcp plus élevé
Décrire les trois composantes principales d’un microscope composé, de l’œil vers l’échantillon
1) Lentille de l’oculaire : ramasse la lumière de l’échantillon et magnifie image (souvent 10x)
2) Lentille de l’objectif : magnifie l’échantillon
3) Lentille condensatrice : focalise la lumière de la source sur l’échantillon (est située en dessous de l’échantillon)
Définir la microscopie optique, et donner les 4 sous-types
Technique qui utilise lumière visible pour illuminer échantillon et créer image
1) En champ clair
2) À contraste de phase
3) En champ sombre
4) À contraste interférentiel
Décrire les 4 sous-types de microscopie optique, et comparer (avantages/inconvénients)
1) En champ clair : illumination par transmission de lumière blanche, traverse directement ou est réfléchie par échantillon
A ; Simple, peu dispendieuse
I ; Nécessité de marquage (cell. sont transparentes), faible contraste et résolution
2) À contraste de phase : met en valeur différences d’indice de réfraction et de contraste, peut visualiser cell vivante sans teinture
A ; Visualiser cell vivantes, pas besoin de produits chimiques ou préparations,
I ; Bcp de signaux hors de focus
3) En champ sombre : contraste provient de lumière diffusée par échantillon, améliore contraste d’échantillons transparents non teintés
A ; Visualiser cell vivantes, bon rapport signal/bruit
I ; Limité échantillons qui diffusent bien lumière
4) À contraste interférentiel : utilise modifs optiques pour exagérer changement propriétés diffusion lumière des structures cell
A ; Visualiser cell vivantes, bon rapport signal/bruit, surligne bords et ombre échantillon ce qui crée aspect tridimensionnel
I ; Limitée à un seul mince plan focal à la fois
Définir la microscopie à fluorescence et donner les 4 sous-types
Technique utilisant un microscope optique composé
équipé d’un émetteur à laser qui permet la sélection
d’une longueur d’onde précise, activant des fluorophores (substances chimiques pouvant émettre lumière après photoexcitation) qui illuminent échantillon
1) À fluo standard (épifluorescence)
2) À fluo confocale
3) À deux photons (multiphotonique)
4) STED (déplétion par émission stimulée)
Décrire les 4 sous-types de microscopie optique, et comparer (avantages/inconvénients)
1) À fluo standard (épifluorescence) : lumière passe à travers filtre d’excitation (spécifique à longueur d’onde donnée) absorbée par fluorophores dans échantillon, produit émission longueur d’onde plus grande, fluo filtrée par filtre émission (spécifique à longueur d’onde donnée), puis dans objectif
A ; Plusieurs fluorophores simultanément, très bon rapport signal/bruit, très sensible (détection molécules en faible quantité), acquisition image simple)
I ; photoblanchiment (dim. lumière émise par fluorophore avec le temps), phototoxicité (lumière peut causer mort cell), bruit peut être élevé (fluo non-spécifique, ou autofluo tissulaire), pas efficace pour échantillons épais
2) À fluo confocale : illumination focalisée sur différents plans focaux consécutivement, recomposition par ordinateur des images de plans focaux individuels subséquemment pour former image 3D
A ; imageries d’échantillons épais, images extrêmement nettes, seules images dans plan focal sont ramassées
I ; requiert illumination long terme (aug. photoblanchiment), lent (difficile d’observer évènements rapides)
3) À deux photons (multiphotonique) : fluorophore est excité en absorbant 2 photons de moindre énergie (spectre infrarouge) simultanément
A ; visualisation cell structures plus profondes, utilise ondes IR qui entrent plus facilement dans tissu sans phototoxicité, excitation limitée au plan focal (réduit photoblanchiment)
I ; nécessite équipements spécialisés et coûteux
4) STED (déplétion par émission stimulée) : similaire à confocale, deux rayons laser (un pour exciter bornes fluo d’un échantillon, autre pour déplétion). Produit images à super-résolution en désactivant sélectivement des fluorophores.
Comme diminuer limite de résolution de diffraction avec un beignet, avec ce qu’on veut observer au centre.
Expliquer le principe de la microscopie électronique
Faisceau de particules d’électrons utilisé au lieu d’un faisceau de photons pour illuminer un échantillon et créer image bcp plus agrandie (jusqu’à 5M fois vs 2k fois optiques), grâce à longueur d’onde plus petite de l’électron.
Donner quelques limitations de la microscopie électronique
- Échantillons sont fixés et traités avec agents chimiques, donc impossible d’observer cell vivantes
- Traitement du tissu peut causer artefacts visuels
