Cours 9 - Identification ADN/protéines et clonage (complet)

Question 1

OBJECTIFS

Answer 1

• Savoir les différents types de criblage (génétique, in silico, moléculaire)
• Comprendre les différences entre criblage génétique classique ou inversé
• Comprendre les différentes étapes du clonage moléculaire
• Connaitre le concept de signalisation intracellulaire
• Connaitre les différences entre anticorps monoclonaux et polyclonaux
• Comprendre les méthodes pour la détection et quantification des protéines
• Déterminer les interactions, le type de modification post-traductionnelles des protéines

Question 2

Comparer en surface les caractéristiques du criblage génétique classique et inversé

Answer 2

Classique : GÉNÉRER hypothèses

• Identifier gènes importants pour phénotype biologique
• Milliers de gènes à la fois

Inversé : ÉVALUER hypothèses

• Sélectionner gène, déterminer phénotypes associés
• 1 gène à la fois

Question 3

Décrire les 6 étapes du criblage classique

Answer 3

1) Élaborer test de mesure phénotype : simple, quantitatif, distinguer animaux phéno anormaux de normaux

2) Mutagenèse des embryons : 3 types ;
- Chimique
- Irradiation (UV)
- Insertion (transposons)

3) Dépistage phéno anormal : après prod 100 à 1000 lignées, chacune évaluée par test de l’étape 1, celles avec phéno sont maintenues
4) Test de complémentation : si plusieurs mutants présentent même phénotype, croisements pour déterminer si mutations sont sur même gène ou non
5) Localiser gène : analyse de liaison (pour mut chimique et irradiation), ou séquence du transposon (pour insertion)
6) Cloner gène : identifier séquence d’ADN

Question 4

Comparer (avantages et inconvénients) les 3 modes de mutagenèse utilisées dans le criblage classique

Answer 4

1) Chimique : provoque muts ponctuelles (1 seul nucléotide)
A ; Permet nombreuses muts différentes
I ; Difficile à cartographier

2) Irradiation : provoque rupture de l’ADN double brin, réparation cause grandes délétions ou réarrangements chromosomiques
A ; Facile à cartographier (analyse cytogénétique)
I ; Pas limitée à un seul gène, empêche analyse fine

3) Insertion : contient gène marqueur, possibilité d’insérer dans région codante (perturbe séquence d’a.a), ou non-codante adjacente (perturbe épissage ou expression)
A ; Facile à cartographier (séquence transposon connue)
I ; Transposition secondaire possible

Question 5

Quelles sont les deux méthodes utilisées pour le criblage inversé?

Answer 5

1) Knockouts

2) Édition du génome

Question 6

Nommer les trois techniques d’édition du génome

Answer 6

1) CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced
Short Palendromic Repeat - ARN / Cas9 - nucléase)
2) ZFN (Zinc Finger Nuclease)
3) TALEN (Transcription Activator-Like Effector Nuclease)

Question 7

Décrire le fonctionnement de la technique CRISPR/Cas9

Answer 7

1) ARN homologue à ADN cible, et portant mut à introduire, guide Cas9 vers site de clivage
2) Cas9 clive en amont de la séquence PAM, produit une rupture double brin

3) Réparation :
a) HR ; permet knock-in (ajout de séquence) si on inclut une séquence à insérer
b) NHEJ ; permet knock-out (par décalage cadre de lecture)

Voir diapo 21

Question 8

Décrire et comparer (avantages/inconvénients) les 6 méthodes de criblage chez l’humain

Answer 8

1) Marqueurs microsatellites (diapo 23) : empreinte microsatellite chez membres de même famille, c’est ce qu’on cherche
A ; Très polymorphique (changent d’une personne à l’autre)
I ; Couverture inégale (peut y avoir des trous parfois)

2) Micropuce SNP (diapo 24) : marqueurs fluos lorsqu’hybridés, qui ont un nucléotide différent entre eux
A ; Grande quantité de marqueurs
I ; Peu polymorphique (slm 2 options, hybridation ou non)

3) Analyse de liaison : étude des marqueurs en commun chez personnes atteintes, puis calcul de score LOD (probabilité que empreinte soit associée à maladie)
A ;
I ; Nécessite grandes familles

4) Études d’association (GWAS) : marqueurs sont-ils associés aux atteints
A ;
I ; Pas de lien de causalité entre séquence et phéno, nécessite bcp d’individus

5) Séquençage exome : fragmentation ADN, hybridation avec sondes homologues à cible, lavage des fragments non-hybridés, séquençage des fragments hybridés, alignement et identification des exons variants
A ; Identifie directement variants, pas de grandes familles
I ; Couvre peu du génome (2%), dispendieux

6) Séquençage du génome : similaire à séq. exomes, mais sans capture (pas de sondes)
A ; Identification directe des variants possibles, pas de grandes familles, couvre génome complet (preque…)
I ; dispendieux, interprétation limitée (pcq énormément de variants)

Question 9

Pourquoi faire un criblage inverse chez un modèle animal après un criblage classique chez l’humain?

Answer 9

Pour valider l’association génotype-phénotype

Question 10

Quel est le but d’un criblage “in silico”? Et nommer les 3 bases de donnée utilisées

Answer 10

IDENTIFIER par une approche bio-informatique gènes ou protéines d’intérêt.

BLAST, Ensembl, UCSC

Question 11

Pourquoi faire un criblage moléculaire?

Answer 11

IDENTIFIER gènes en lien avec processus biologique spécifique

Question 12

Comparer (avantages/inconvénients) les deux techniques utilisées pour le criblage moléculaire

Answer 12

1) Micropuce ADNc : extraction d’ARNm d’échantillon, puis utilisation de transcriptase inverse pour produire ADN complémentaire (ADNc), qu’on hybride à un ensemble de micropuces (microarray) contenant des milliers de brins potentiellement complémentaires. L’hybridation ADNc-micropuce peut être détectée par ordi.
A ; Analyse simple, abordable
D ; Sondes (micropuces) prédéterminées

2) Séquençage d’ADNc : extraction d’ARN d’échantillon, séparation et isolation par type (ex. ARNm, ARN non-codant, ARNr, etc.), conversion en ADNc puis séquençage
A ; séquençage de tous les transcrits exprimés dans tissu, possibilité de détecter transcrits peu abondants
I ; dispendieux, nécessite expertise

Question 13

Décrire brièvement les étapes de la PCR

Answer 13

1) Utilisation de chaleur pour séparer l’ADN matrice
2) Hybridation des amorces
3) Synthèse d’ADN
4) Amplification (répète les étapes 1 à 3)

Question 14

Qu’est-ce que la RT-PCR quantitative?

Answer 14

Donne des infos sur la quantité de fragments produit en temps réel au cours de la PCR de transcription inverse (RT-PCR).
On hybride une sonde avec un marqueur fluo et un quencher (empêche la fluorescence). Lors de la synthèse d’ADN, la polymérase déplace la sonde, sépare le quencher du marqueur et la fluorescence a lieu. Plus on a de fluorescence, plus on a de nouveaux brins sythétisés.

Question 15

Quels sont les composantes les plus courantes d’un vecteur d’ADN?

Answer 15

Origine de réplication, marqueur de sélection (ex. gène de résistance à antibio)

Question 16

Différencier les deux types de vecteurs

Answer 16

De clonage : ADN est répliqué, mais pas exprimé

D’expression : ADN est répliqué et peut être exprimé grâce à promoteur approprié

Question 17

Décrire les trois méthodes de purification de l’ADN

Answer 17

1) Électrophores sur gel d’agarose : ADN chargé négativement placé entre anode(-) et cathode(+), SELON SA TAILLE (plus gros = plus proche d’anode)
2) Gel et bromure d’éthidium : insertion d’agents intercalants qui fluorescent lorsqu’exposés aux UV, intensité de bande selon nombre et taille de fragments.
3) Purification chimique : à partir de bactéries, mini/midi/maxi kits commerciaux disponibles selon quantité d’ADN purifié voulu

Question 18

Expliquer le principe de la technique d’identification par séquençage de Sanger

Answer 18

1) On fait PCR avec combinaison de matrice obtenue après PCR précédente, nucléotides normaux (dNTP) et didésoxyNTP (ddNTP) fluorescents. Ces derniers terminent la synthèse d’ADN, pcq peuvent pas se faire attacher un autre dNTP.
Chaque ddNTP a une couleur différente (ex. A en rouge, C en bleu, etc.) de sorte qu’on peut les reconnaître. À force des cycles, on aura toutes les longueurs possibles de fragments.

2) Migration dans capillaires des séquences selon leur poids (donc grosseur) et détection de la couleur par ordinateur.
3) On obtient un chromatogramme qui nous permet de vérifier que l’insert s’est fait au bon endroit, et s’il porte la mut désirée.

Question 19

Caractériser très brièvement les 7 étapes du clonage

Answer 19

1) Isolation du matériel génétique
2) Amplification par PCR
3) Clivage du vecteur avec enzyme de restriction
4) LIGATION : liaison de l’ADN préparé à l’ADN du vecteur
5) TRANSFORMATION : incorporation de l’ADN préparé au génome de la cible
6) Purification et isolation des clones
7) Séquençage pour vérification du succès

Question 20

Nommer les 7 méthodes possibles pour déterminer le rôle d’une protéine

Answer 20

1) Signalisation intracellulaire
2) Production d’anticorps
3) Purification des protéines
4) Expression des protéines
5) Interaction protéines-protéines
6) Modifications post-traductionnelles
7) Interaction protéine-ADN

Question 21

Pour la signalisation intracellulaire, différencier les deux voies

Answer 21

Intracell. : changements métaboliques et structuraux

Extracell. : récepteurs membranaires

Question 22

Décrire brièvement le processus général de production d’anticorps

Answer 22

Injecte antigène à un animal, on attend qu’il produise anticorps, puis on les recueille.

Question 23

Décrire les deux méthodes de purification des protéines

Answer 23

1) Chromatographie : séparer mélange de prots sur colonne, interaction de prots avec matrice (par charge, taille, hydrophobicité, affinité pour matrice et nature de matrice)
2) Immunoprécipitation : utilisation d’anticorps spécifiques pour lier prot d’intérêt, puis lavage des prots non-liées

Question 24

Décrire les 5 méthodes pour mesurer l’expression des protéines

Answer 24

1) Western blot/immunobuvardage : la plus utilisée, trie prots par taille (ou autre) avec électrophores sur gel puis sélectionne les prots avec anticorps secondaire marqué (fluo, enzyme ou radioactif) reconnaissant anticorps primaire

2) ELISA : méthode presque identique au Western blot, mais :
- Quantifie nanogrammes de prots (au lieu de microgrammes pour WB),
- Dénaturation pas prots
- Quantification plus précise
- Distingue pas les isoformes

3) Essai radioimmunologique (RIA) : on met prots non-radio dans solution de prots radios avec anticorps, et détermine ratio de prots non-radios liées vs non-liées pour identifier concentration d’un échantillon
4) Immunohistochimie (IHC) : visualiser prots (au lieu de quantifier) dans l’espace, pas très quantitatif
5) Immunomicroscopie électronique (IME) : IHC avec observation au microscope électronique, pour visualiser spatialement les structures sous-cellulaires (ex. noyau, mitos, etc.)

Question 25

Qu’est-ce que le fractionnement cellulaire?

Answer 25

La séparation des organites individuelles d’une cellule selon leur poids en utilisant des séries de centrifugations de différentes vitesse et durée.

Question 26

Décrire la méthode de mesure d’interactions protéine-protéine

Answer 26

1) Co-immunoprécipitation : on met anticorps liés sur billes dans la solution de prots, anticorps reconnaissent prots qui adhèrent subséquemment aux billes. Les prots qui interagissent avec prots sur billes sont attachées et précipitent. On peut ensuite enlever les billes et identifier les prots avec soit :

• Western blot si partenaires protéiques connus
• Spectrométrie de masse si partenaires protéiques inconnus

Question 27

Expliquer le principe de la spectrométrie de masse?

Answer 27

Comparaison ratio masse - charge des protéines, peptides et leurs fragments, avec base de donnée pour identifier prots

Question 28

Décrire et comparer (avantages/inconvénients) les trois méthodologies principales pour étudier les interactions protéine-ADN

Answer 28

1) Test de mobilité électrophorétique (EMSA) : déterminer si prot capable d’interagir directement avec courte séquence spécifique d’ADN.
On met ADN avec prots sur gel électrophores, les ADN qui interagissent se déplacent plus lentement.
- Contrôles = essais compétitifs (autre molécule qui peut lier ADN) pour être sûr que pas défaut de liaison.
A ; détecte évènements rares, tester plusieurs sondes
I ; in vitro, pas quantitatif

2) Immunoprécipitation chromatine (ChIP) : déterminer si prot interagit avec région d’ADN spécifique.
On met prot avec ADN spécifique, ils se lient, puis on immunoprécipite, on détache ensuite prots et ADN et on PCR l’ADN.
- Contrôles = liaison ADN-prot connue, anticorps non-spécifiques et amorces non-spécifiques
A ; matériel de départ est des cellules vivantes
I ; impossible si interaction ADN-prot directe ou par complexe

3) Essai luciférase : déterminer si prot active ou réprime expression gène cible grâce à gène codant luciférase (enzyme de luciole, bioluminescente) juste en aval du gène cible. S’il y a transcription, il y aura luminescence.
A ; connexion fonctionnelle, quantitatif
I ; détecte pas si interaction directe ou par complexe

Question 29

Caractériser la variation ChIP-Seq de la méthode d’immunoprécipitation de chromatine

Answer 29

Même chose que ChIP, mais on séquence l’ADN au lieu de PCR

Question 30

Vrai/Faux : les modifications post-traductionnelles affectent les propriétés structurelles et fonctionnelles des prots

Answer 30

Vrai

Question 31

Vrai/Faux : il est possible de tester toutes les modifs post-trad par la même méthode

Answer 31

Faux, chaque modif post-trad a son propre test