Cours 4 - Électrophysiologie (complet)

Question 1

Définir électrophysiologie

Answer 1

Domaine d’exploration de l’activité électrique des neurones vivants et des processus moléculaires et cellulaires qui régissent leur signalisation.

Question 2

À combien est le potentiel de repos neuronal?

Answer 2

Entre -60 et -70 mV

Question 3

Vrai/Faux : canaux sodiques ne participent pas au maintient du potentiel de repos

Answer 3

Vrai

Question 4

Définir potentiel d’équilibre pour un ion, et donner les valeurs du potentiel d’équilibre du K+, Na+ et Cl-

Answer 4

Potentiel auquel entrée et sortie ionique est égale pour un ion donné.

K+ = -75 mV
Na+ = +55 mV
Cl- = -60 mV

Question 5

Différencier PPSE et PPSI

Answer 5

PPSE : Potentiel Post-synaptique Excitateur, généralement médié par le glutamate, cause dépolarisation

PPSI : Potentiel Post-synaptique Inhibiteur, cause hyperpolarisation

Question 6

Pourquoi est-ce que les potentiels d’actions partent slm du cône d’activation?

Answer 6

Pcq grande densité de canaux Na+ voltage-dépendants, donc moins haut seuil de déclenchement.

Question 7

Expliquer le mécanisme du potentiel d’action à l’aide du graphique de la diapo 68

Answer 7

Voir diapo 11

Question 8

Décrire les 11 éléments essentiels d’un poste d’électrophysiologie, schématiser si nécessaire

Answer 8

1) Perfusion : avec solution d’électrolytes pour garder neurones enregistrés en vie
Ex. ACSF (Artificial CerebroSpinal Fluid)

2) Microélectrode d’enregistrement et/ou électrode de stimulation : en verre, remplie de la solution d’électrolytes pour enregistrer (d’enregistrement) ou appliquer un courant électrique (de stimulation)
3) Étireur : fabrique microélectrode en étirant tubes de verre
4) Préamplificateur : premier niveau détection signal, transmet vers amplificateur et vers électrode de référence
5) Microdrive : positionne électrode dans tissu, contrôlé par micromanipulateur pour mouvements précis
6) Micromanipulateur : contrôle microdrive, permet positionnement précis microélectrode grâce à mouvements fins (ex. 0,1 um) sur les axes X, Y et Z.
7) Amplificateur : amplifie signal du préampli, exécute aussi changements imposés par expérimentateur
8) Interface analogue-digital : digitalise le signal analogue de l’amplificateur pour qu’il soit compatible avec un ordinateur
9) Stimulation isolation unit : réduit le bruit électrique lié à une prise régulière en générant le pulse via une batterie qu’il transmet à l’électrode de stimulation
10) Cage de Faraday : isole poste contre bruit électrique de l’extérieur
11) Table anti-vibration : contre les effets de vibration de la table sur le positionnement de l’électrode

Voir diapo 12

Question 9

Nommer et décrire brièvement les trois types d’enregistrements in vitro

Answer 9

1) Expression hétérologue : expression d’une protéine cible dans un autre système que celui d’origine
2) Cellules primaires isolées : culture de neurones dissociés à partir d’une région d’intérêt
3) Tranches de cerveau : cultures de coupes de tissu entier

Question 10

Donner avantages/désavantages de l’enregistrement in vitro des cellules primaires isolées

Answer 10

Avantages :
- Possibilité d’étudier protéine exprimée de manière endogène (ex. un canal ionique)

Désavantages :
- Cellules forment connexions synaptiques en culture, pas représentatif connexions neuronales normales dans circuit

Question 11

Donner avantages/désavantages de l’enregistrement in vitro des tranches de cerveau

Answer 11

Avantages :

• Enregistrements intracellulaires plus facile que in-vivo (le tissu ne bouge pas!)
• Étudier rôle neurones dans circuit
• Cultures à long terme permettent l’expression de protéines ectopiques (via virus, canon à gènes, etc.)

Désavantages :

• Visibilité pire qu’avec des cultures isolées primaires
• Substances pharmacologiques ajoutés au bain doivent pénétrer dans le tissu
• Connectivité synaptique pourrait changer dans les cultures à long terme (comme cellules primaires isolées)

Question 12

Nommer les trois types de techniques d’électrophysiologie

Answer 12

1) Enregistrement extracellulaire
2) Enregistrement intracellulaire
3) Patch-clamp

Question 13

Que mesure spécifiquement la technique d’enregistrement extracellulaire?

Answer 13

Différences de potentiels sur la surface extérieure d’un neurone actif.

Question 14

Donner avantages/désavantages de la technique d’enregistrement extracellulaire

Answer 14

Avantage :
- Facile à faire

Désavantage :
- Impossible mesurer évènements sous le seuil d’une seule cellule

Question 15

Expliquer le phénomène de potentiels de champ locaux

Answer 15

En plus du potentiel présynaptique, on détecte le potentiel postsynaptique qui découle de l’ouverture des récepteurs au sodium ligand-dépendants.

Question 16

Que mesure spécifiquement la technique d’enregistrement intracellulaire?

Answer 16

Petits changements du potentiel de membrane local causés par évènements synaptiques

Question 17

Donner avantages/désavantages de la technique d’enregistrement intracellulaire

Answer 17

Avantage :
- Échange minimal entre solution de la pipette et le cytoplasme

Désavantages :

• Difficile à réaliser avec petits neurones
• Enregistrement en voltage imposé impossible (on a besoin de deux électrodes)

Question 18

Décrire généralement la technique d’enregistrement en patch-clamp, et nommer toutes les configurations

Answer 18

Micropipette touche membrane plasmique neuronale, légère succion à l’intérieur de micropipette forme un joint étanche entre les deux (giga-ohm-seal), ce qui isole morceau de membrane sous la pipette du reste de la membrane

Configurations :

• Pipette attachée à la cellule (« cell attached configuration »)
• Cellule entière (« whole-cell configuration »)
• Extérieur-extérieur (« outside-out configuration »)
• Intérieur-extérieur (« inside-out configuration »)
• Patch perforé

Question 19

Expliquer la configuration patch-clamp en patch perforé

Answer 19

Solution de la pipette contient un produit chimique qui provoque de petites perforations dans la membrane. Cela permet petite conductance ionique mais pas de fuite du cytoplasme.

Voir diapo 46 pour schéma

Question 20

Donner avantages/désavantages de la configuration patch-clamp en patch perforé

Answer 20

Avantages :

• Possibilité d’enregistrer un canal ionique isolé
• Excellent contrôle des milieux intra et extracellulaires

Désavantage :
- Risque de changer propriétés du canal à cause de l’altération de l’environnement cellulaire

Question 21

Expliquer la configuration patch-clamp en extérieur-extérieur

Answer 21

Milieu intracellulaire est l’intérieur de pipette ; extracellulaire, le bain. Changer rapidement propriétés (concentrations ioniques entre autres) milieu extracellulaire (pcq peut changer la solution dans le bain rapidement).

Question 22

Expliquer la configuration patch-clamp en intérieur-extérieur

Answer 22

Milieu extracellulaire est l’intérieur de pipette ; intracellulaire, le bain. Changer rapidement propriétés du milieu intracellulaire.

Question 23

Donner avantages/désavantages de la configuration patch-clamp en pipette attachée à cellule

Answer 23

Avantages :

• Facile
• Milieu intracellulaire intact
• Possibilité d’enregistrer un canal ionique isolé

Désavantages :

• Contrôle pas milieu intracellulaire
• Valeur potentiel membranaire inconnue

Question 24

Donner avantages/désavantages de la configuration patch-clamp en cellule entière

Answer 24

Avantages :

• Enregistrements en voltage imposé (grand contrôle du potentiel membranaire vu grande ouverture de pipette)
• Contrôle du milieu intracellulaire via échanges cytoplasme-solution

Désavantage :
- Perte de constituants intracellulaires via échanges cytoplasme-solution

Question 25

Décrire la procédure pas-à-pas de l’enregistrement en patch-clamp

Answer 25

1) Remplir pipette avec solution intracellulaire (ex. ACSF)
2) Perfuser chambre d’enregistrement
3) Mettre tranche dans chambre
4) Placer électrodes de stimulation
5) Placer la pipette d’enregistrement dans ACSF dans chambre
6) Appliquer pression positive (vérifier si bulles d’air obstruent pointe)
7) Mettre voltage imposé à 0 mV
8) Approcher tissu et positionner électrode à côté neurone
9) Approcher membrane doucement et vérifier formation d’une fossette
10) Relâcher pression et appliquer succion
11) Vérifier joint giga-Ohm
12) Vérifier validité des paramètres sur programme de l’ordinateur
13) Observer ratio Rm vs Ra
14) Effectuer les enregistrements!

Question 26

Comparer Rm et Ra dans l’enregistrement patch clamp

Answer 26

Ra = résistance au point d’accès (entre la membrane et la pipette)

Rm = résistance membranaire du neurone complet

Rm doit être au moins 10 fois plus grande que Ra, sinon fuite du cytoplasme localement et invalidation des mesures