Cours 6

Question 1

Quelles sont 4 techniques de visualisation de la structure du SN?

Answer 1

Préparation de tissus
Visualisation de structures
Visualisation d’expression des gènes et protéines
Visualisation des circuits

Question 2

Pourquoi étudier la structure du SNC? (2)

Answer 2

Générer des hypothèses concernant la fonction des différents neurones
Savoir comment ils influencent les circuits neuronaux et comportementaux

Question 3

Quelle était la théo de Cajal?

Answer 3

De la structure à la fonction

Les neurones sont les unités structurelles et fonctionnelles de base du système nerveux.

Question 4

Quelles sont les 4 principes de la doctrine neuronale?

Answer 4

le neurone est l’unité structurelle et fonctionnelle fondamentale du système nerveux
les neurones sont des cellules discrètes qui ne sont pas continues avec d’autres cellules
le neurone est composé de 3 parties –les dendrites, l’axone et le corps cellulaire
l’information circule le long du neurone dans une direction (des dendrites à l’axone, via le corps cellulaire)

Question 5

Comment se fait la préparation des tissus? (4 grandes étapes)

Answer 5

Le tissu neural est délicat et dégradable
Il est nécessaire de préserver le tissu quasi in vivo
Les 4 grands étapes:
Fixer
Disséquer
Envelopper
Faire des sections

Question 6

Comment se fait la fixation? Pourquoi on le fait?

Answer 6

Utilisation des produits chimiques pour préserver, stabiliser, et renforcer l’échantillon pour en faire des analyses microscopiques
◦Renforcer les interactions moléculaires
◦Désactiver les enzymes protéolytiques
◦Éliminer les microorganismes qui les dégradent

Question 7

Quels sont 2 types d’agents de fixation?

Answer 7

«cross-linking»:
◦Formation des liaisons covalentes
Les aldéhydes: formaldéhyde, para formaldéhyde, glutaraledéhyde
Usage: microscopie photonique
Osmium tetroxide(oxydation)
Usage: microscopie électronique

Déshydratation:
◦Perturbation des lipides, réduction de la solubilité des protéines
Méthanol, acétone

Question 8

Quels sont 2 modes de fixation?

Answer 8

Immersion:
◦Temps requis dépend de la taille/épaisseur du tissu
Perfusion transcardiaque:
◦Par pénétration du ventricule gauche

Question 9

Comment se fait la dissection? (3)

Answer 9

retirer le cerveau du crâne
microdisséquer les régions d’intérêt, si nécessaire
◦la decision est basée sur le type d’analyses qui suivent

Question 10

Comment se fait la cryopréservation? (3)

Answer 10

Le tissue est submergé dans un solution de 30% sucrose pour 48-72hr
l’eau peut endommager les tissus à la congélation
Le sucrose remplacel’eau, le tissu devient moins flottant

Question 11

L’enveloppement sert à quoi? Quels sont 4 exemples d’agents utilisés?

Answer 11

Stabiliser la structure du tissu
Faciliter les coupes
◦OCT
◦Gélatine
◦Paraffine
◦Plastique

Question 12

Comment on fait des sections? (3 machines et leurs caractéristiques)

Answer 12

Microtome
Congelé ou non-congelé
OCT, paraffine, plastique
Section moyenne: 25-100 μm

Cryostat
Congelé
-20C à -30C
Section mince: 10-50 μm (je fais 7 μm)

Vibratome
Lame vibrante
Non-congelé
Possibilité d’utiliser avec des tissus vivants
Section épaisse: 100-400 μm

Question 13

Quelles sont les 3 coupes possibles?

Answer 13

Coronale
Sagittale
Horizontale/Transverse
avant de faire l’enveloppement, il fait décider quels coupes on va faire pcq fait enveloppement diff selon plan de coupe

Question 14

Comment se fait la visualisation des morpho? (4)

Answer 14

75% de la masse du cerveau est composée d’eau
Les sections sont transparentes!
Il est nécessaire d’avoir un contraste entre les structures spécifiques pour les distinguer des structures aqueuses
Utilisez des colorants pour visualiser les structures

Question 15

Quels sont les colorants du soma?

Answer 15

Colorants basophiles
◦pH>8 (basique)
◦Marque des molécules acides (ADN, ARN)
Noyaux et ribosomes
◦Les exemples non-fluorescents:
Cresylviolet (Nissl)
Hematoxyline
Thionine
Les teintures Nisslpréfèrent l’ARN (RER, ribosomes) qui est plus abondant dans les neurones
Fluo: Marqueurs des noyaux par l’intercalation entre les spirales hélicoïdales de l’ADN
DAPI
Hoechst (bisbenzamide)
Propidiumiodide

Question 16

Les teintures basophiliques permettent quoi? (2)

Answer 16

◦l’examen de l’architecture cellulaire

◦La visualisation des aspects macroscopiques des régions distinctes du cerveau

Question 17

Qu’est-ce qu’un colorant des fibres? (3)

Answer 17

Marque la myéline de la matière blanche
Utilisé en combinaison avec des colorants basophiles sur des sections adjacentes
Attention: impossible d’identifier des fibres individuelles

Question 18

Qu’est-ce que la coloration de Golgi (2 avantages et un désavantage et l’utilité)?

Answer 18

Marque complètement des neurones individuels et leurs processus
2 avantages:
◦Les neurones sont marqué complètement (soma, axones*, dendrites)
c’est idéal pour visualiser le champs dendritiques
◦Seulement de 5 à 10% des cellules totales sont colorées
Désavantage:
◦Ne peut pas contrôler les neurones marqués
•Utiles dans les études de la neurodégénérescence
*Golgi ne marque pas tout l’axone (il n’y a pas un accumulation dans les axones myélinisées mais il peut marqué les axones terminales et non-myélinisées.)

Question 19

Le marquage intracell permet quoi? Donne un exemple de marqueur et son utilité

Answer 19

Permet de faire le lien entre les structures et les zones du cerveau avec l’activité ou la fonction du neurone dans le cerveau
Neurobiotine injectée dans un neurone vivant.
On peut fixer et faire l’analyse histologique après les enregistrements d’activité

Question 20

Comment fctionne le marquage fluo intracell? (3)

Answer 20

Génétique: expression des fusion de GFP et variantes
Fluorophores: Alexa488, Rhodamine, Cy5
Possiblilitéde faire une amplification (ie. Il n’y pas de relation1:1)

Question 21

Qu’est-ce que la technique quantum dots?

Answer 21

nanocrystauxsemi-conducteurs, résistants au photobleaching
Convertissent un spectrum de lumière en diff couleurs
+ grand dot = + grande longueur d’onde (rouge), plus petit = bleu

Question 22

Comment fctionnent les méthodes de marquage avec sonde? (2)

Answer 22

Une sonde (ex. anticorps ou brin antisense) n’est pas visible en elle-même
Doit être conjugué à un marquage qui peut-être visible par lui-même OU peut-être réactif avec d’autres produits chimiques pour rendre un produit visible

Question 23

Qu’est-ce que le marquage chromogénique? Donne 4 exemples

Answer 23

Réaction enzymatique avec un substrat qui produit un composé coloré et visible par microscopie photonique
◦Horseradishperoxidase(HRP) ►brun/noir
◦B-galactosidase/X-Gal ►bleu
◦Conjugaison de Biotin avec avidin/streptavidine
◦Digoxigenin

Question 24

Qu’est-ce que le marqueur biotine? (5)

Answer 24

Soluble
Non-toxique
Iontophorèse facile
Livraisonpar un courant électrique comme on stimulerait un neurone
Reste dans la cellule
On peut visualiser avec des marqueurs conjugués avec avidine, en microscopie photonique, fluorescente et électronique

Question 25

Quels sont 2 autres méthodes de marquage intracell?

Answer 25

``` Radioactif ◦Réaction directe: marquage de 1:1 ◦Utile pour la localisation des récepteurs, la prolifération et le trafic des protéines Or ◦Matériaux dense aux électrons ◦Microscopie électronique ```

Question 26

Comment on fait la visualisation des gènes et prot?

Answer 26

Hybridization«In situ» ◦Méthode pour visualiser les acides nucléiques ADN et ARN sont possible ◦Déterminer quandet ouun gène spécifique est exprimé ◦Limitation PLUS importante: impossible de savoir où la protéine fonctionnelle est exprimée dans la cellule

Question 27

Comment on fait l'ISH ARNm? (4)

Answer 27

Il faut connaître la séquence génétique de l’ARNm Faire une sonde d’acide nucléique simple-brin complémentaire («anti-sense») Marquer la sonde pour la détection (nucléotides radioactifs, etc) Mettre la sonde avec le tissus: faire un duplex de sonde et ARNm

Question 28

Quels sont 3 contrôles importants de l'ISH?

Answer 28

Une sonde «sens» Autres sondes faites pour des régions différentes du même gène/transcrit Possibilité de présences de fluorescence (FISH)

Question 29

Qu'est-ce que le Allen Brain Atlas?

Answer 29

catalogue de tous les transcrits dans le cerveau visualisation de l'expression d'ARNm dans toutes les coupes, comme ça on a pas tjrs besoin de faire l'hybridation nous mêmes, ils l'ont déjà fait

Question 30

Comment on fait la détection des prot par immunohistochim? (3)

Answer 30

Méthode de visualisation des protéines et autres biomolécules Avantagepar rapport à d’autres méthodes: visualisation des protéines dans les structures subcellulaires (résolution spatiale) ◦Immunohistochimie: tissus ◦Immunocytochimie: cellules ◦Immunofluorescence: avec la détection fluorescente Effectuée grâce à des anticorps

Question 31

Qu'est-ce qu'un Ac? (4)

Answer 31

Anticorps monoclonal: Reconnait un epitope d’antigène Anticorps polyclonal: Reconnait plus d’un epitope d’antigène Produits dans des lignées cellulaires spécialisées ou les animaux vivants L’optimisation est spécifique pour chaque anticorps ET chaque application (exp)

Question 32

Qu'est-ce que la méthode IHC?

Answer 32

Tissu/cellule fixée Anticorps primaire: spécifique pour la protéine ciblée Détection: Directe IHC; conjugaison de fluorophore/enzyme chromogènique Indirecte IHC: utilise un anticorps secondaire conjugué de fluorophore/enzyme chromogénique Amplification de signal: c’est quand plus d’un anticorps secondaire peut reconnaitre l’anticorps primaire

Question 33

Comment vérifiez-vous la spécificité de votre anticorps? (2)

Answer 33

Un contrôle positif ◦Un spécimen qu’on connait peut contenir l’antigène Des contrôles négatifs ◦Un spécimen qu’on connait qui ne contient pas l’antigène ◦Pré-incubation de l’anticorps avec un antigène avant mise en présence du spécimen Déplétion d’anticorps….totalement associé à sa cible ◦IHC indirecte: un spécimen incubé sans l’anticorps primaire mais seulement avec l’anticorps secondaire Vérification qu’il n’y a pas d’association non-spécifique

Question 34

Quels sont les 4 facteurs qui influencent l'IHC?

Answer 34

IHC est simple…mais le signal peut-être affecté par plusieurs facteurs ◦Méthode de fixation ◦Concentration d’anticorps ◦Durée de temps d’incubation de l’anticorps avec le spécimen ◦Accessibilité de l’antigène

Question 35

Qu'est-ce que l'histochim enzymatique? Elle identifie quoi? Donne un exemple

Answer 35

Utilisation de l’activité enzymatique endogène Obtention de sous-produits coloré après incubation avec des chromogènes Identification des neurones métaboliquement actifs Cytochrome c oxidase: marque mito et barrel cortex est très actif métaboliquement donc marque bcp

Question 36

Qu'est-ce qu'un gène rapporteur? | Pourquoi les utiliser à la place des anticorps?

Answer 36

◦Un gène non-endogènequi est exprimé et contrôlé par un promoteur Gène rapporteur peut exprime par son promoteur propre ou insert a coté d’une promoteur endogène ◦Possibilité d’examiner l’expression spatialeet temporaled’un gène en mesurant le rapporteur

Question 37

Donne un ex de gène rapporteur

Answer 37

LacZ a été mis à côté de Satb2 donc Satb2 est pu exprimé et LacZ est exprimé partout ou Satb2 aurait été exprimé

Question 38

Qu'est-ce que la photoactivation des prot? et la photoconversion?

Answer 38

Rapporteur qui devient fluorescent après excitation avec un laser Des protéines sont photoactivéesdans une zone restreinte (spatialement sélective) Rapporteur qui peut changer son émission aprèsconversion avec un laser Vert -> rouge

Question 39

Pourquoi faire la visualisation des circuits?

Answer 39

Un neurone ne fonctionne pas isolément C’est important de connaître les cellules spécifiques du cerveau qui fournissent «l‘input» synaptique à un neurone d'intérêt, ainsi que les cellules spécifiques auxquelles le neurone se connecte.

Question 40

Comment étudier les circuits

Answer 40

Les traceurs antérogrades et rétrogrades Traceur neuronal: ◦Sonde chimique (ou génétique) qui marque les voies d’axones pour illuminer la connectivité dans le système nerveux ◦Décrit par la direction qu’il traverse dans un neurone Quelques traceurs circulent dans les deux directions D’autres circulent seulement en direction antérograde ou rétrograde Peuvent être fluorescents ou chromogéniques

Question 41

Quels sont 4 pts sur les traceurs?

Answer 41

Le traceur doit être injecté dans un animal vivant Il faut attendre (1 a 7 jours) avant fixation et préparation pour les analyses Traceur antérograde: Devrait être dans le soma et les terminaisons pré-synaptiques des neurones injectés Indique les zones vers lesquelles ces neurones projettent Traceur rétrograde: Devrait être dans le soma des neurones qui projettent à partir de site d'injection

Question 42

Qu'est-ce qu'un traceur trans syn? Donne un exemple

Answer 42

Peuvent traverser des synapses et marquer plusieurs neurones dans un circuit ◦Acides aminés radioactifs (3H-proline, 3H-leucine) mis dans l’environnement local duneurone primaire ◦Quelques acides aminés sont absorbés par des transporteurs ◦Dans la cellule, ces acides aminés sont incorporés dans des protéines ◦Certains traversent l’axone et sont secrétés àla terminaison synaptique et reçus par le neurone de deuxième-ordre ◦Peut être répété pour marquer un neurone trois-ordre ◦Détection par autoradiographie

Question 43

Comment fctionne un traceur trans syn rétrograde avec vecteurs viraux? (un avantage et 2 désavantages et 2 ex)

Answer 43

``` Auto-amplification Marquage progressif des neurones dans un circuit quand ils deviennent infectés Pseudorabiesvirus Herpes simplex virus Avantage ◦Auto-amplification Désavantage ◦Peut tuer les neurones ◦Infection généralisée chez les animaux ◦Plus la durée d’infection est longue= plus le marquage est beau-mais les neurones primaires/ secondaires peuvent mourir ```

Question 44

Quels sont 2 ex de types de traceurs trans syn?

Answer 44

Lectinesdes plantes ◦protéines avec de très hautes affinités pour des sucres spécifiques (ie. Glycoprotéines) ◦Wheatgermagglutinin(WGA) Des virus ◦Pseudorabiesvirus ◦Herpes simples virus ◦(désavantage: si la durée de l'infection est longue, la probabilité que les neurones de première et deuxième ordres meurent, est accrue)