Cours 8: Stratégies pour introduire un gène dans des cellules in vitro et in vivo Flashcards
(31 cards)
1
Q
Pourquoi vouloir introduire un gène dans une cellule? (3)
A
1- Produire une souris transgénique afin d’étudier la fonction d’un gène
2- Étudier les conséquences d’une mutation d’un gène sur le fonctionnement d’une cellule
3- Examiner comment un gène contrôle l’expression d’autres gènes
2
Q
Quelles sont les Trois catégories de stratégies sont utilisées pour
introduire l’ADN d’un gène dans une cellule et la différence entre transfection et transduction?
A
1- force physique: ex. billes d’or
2- produits chimiques: liposomes
3- vecteurs viraux
- Transfection fait référence à une méthode non-virale pour introduire de l’ADN dans une cellule.
- Transduction implique que l’ADN est introduit par un vecteur viral. Les virus s’attachent à la cellule pour injecter l’ADN.
3
Q
Les stratégies d’intro d’ADN dans une cellule ce distinguent par quoi (3) et quels sont les 3 Facteurs qui déterminent la sélection de la stratégie pour introduire l’ADN dans une cellule?
A
Chacune des stratégies se distingue par:
1- le nombre de cellules qui prendront l’ADN
2- le niveau d’expression du gène
3- l’expression dans le temps
Facteurs qui déterminent la sélection de la stratégie pour introduire l’ADN dans une cellule:
1- l’environnement cellulaire
2- type cellulaire
3-le but de l’expérience
4
Q
Comment se fait l’introduction de l’ADN par force physique (3)? Quelles sont les 3 méthodes?
A
- Il s’agit de faire pénétrer l’ADN à travers la membrane cellulaire par
l’utilisation d’une force physique - Ces méthodes sont très efficaces et peuvent être utilisées pour toutes sortes de types cellulaires
- Cependant, elles peuvent conduire à des dommages de l’intégrité de la membrane cellulaire, traumatiser les cellules et ultimement conduire à la mort cellulaire.
Trois méthodes sont présentement utilisées dans les laboratoires:
1- microinjection
2- électroporation
3- biolistique
5
Q
Qu’est-ce que la microinjection? (7)
A
-micro-injection d’ADN en utilisant
une aiguille de verre: très petite aiguille afin de ne pas endommager la membrane cellulaire
-la cellule incorpore l’ADN dans son
génome
-Équipement requis: un microscope, micromanipulateurs afin de placer de façon précise l’aiguille à la surface cellulaire.
Une seule cellule est injectée à la fois
-Cette méthode demande beaucoup de dextérité manuelle et donc n’est pas utilisée de façon routinière par un grand nombre de chercheurs.
-Méthode utilisée pour produire des souris transgéniques: injection d’ADN dans l’oeuf fécondé de souris: ADN incorporé de façon aléatoire dans le génome
-La micro-injection est rarement utilisée pour introduire de l’ADN dans les neurones à cause de leur petite taille et de leur fragilité: très difficiles à micro-injecter
6
Q
Qu’est-ce que l’électroporation? (8)
A
- L’application d’un champs électrique aux cellules induit la formation de pores au niveau de la membrane cellulaire. Ces pores permettent à l’ADN de rentrer dans la cellule
- L’ADN qui est chargé négativement va être repoussé de la cathode vers l’anode dans le champs électrique
- Quand le champs électrique est enlevé, les pores se ferment et donc l’ADN demeure à l’intérieur de la cellule.
- Cette méthode peut être utilisée pour introduire de l’ADN in vitro et in vivo: neurones dissociés, des tranches de cerveau ou embryons.
- L’électroporation est utile pour introduire de l’ADN dans les neurones situés dans des régions qui sont adjacentes aux ventricules. La solution qui contient l’ADN est injectée dans les ventricules.
- La localisation de l’introduction de l’ADN peut être contrôlée par la position des électrodes
- La période de l’introduction de l’ADN peut également être contrôlée. Ex. l’expression peut être dirigée dans des couches spécifiques du cortex cérébral en faisant l’électroporation pendant une période embryonnaire spécifique
- Avantages de l’électroporation: peut transfecter plusieurs types cellulaires in vivo et in vitro. Possible de varier le niveau d’expression du gène en variant la force et le pattern du champs électrique
7
Q
Comment se fait l’électroporation in utero? (5)
A
1- l’embryon est sorti de la mère
2- l’ADN est injecté dans les ventricules de l’embryon
3- En utilisant des électrodes en forme de palette: l’ADN est introduit dans les cellules par un champs électrique qui dirige l’ADN chargé négativement vers l’anode
4- l’embryon est replacé dans la mère
5- Les neurones des embryons qui vont naître exprimeront le gène introduit par électroporation
8
Q
Qu’est-ce que la biolistique? (12)
A
- Le mot provient de balistique biologique: transfert d’un gène par particules en utilisant un fusil à gène (gene gun)
- Produire un mélange de particules de métaux lourds (tungsten ou or) et d’ADN
- Les particules de métaux lourds se lient à l’ADN qui est chargé négativement
- Les particules/ADN sont chargées sur une balle en plastique
- Un gaz pressurisé comme hélium est utilisé pour produire la force qui fait bouger la balle
- La pression du gaz augmente jusqu’à ce qu’elle rupture le disque et ainsi la pression libérée va propulser la balle le long du conduit du fusil à gène
- La balle de plastique est retenue à l’intérieur du conduit par un filtre alors que les particules qui sont liées à l’ADN sont éjectées à travers le filtre.
- Les billes d’or pénètrent la membrane cellulaire et ainsi elles introduisent l’ADN dans la cellule.
- Les cellules transfectées sont souvent dispersées. Ceci peut être un avantage lorsque nous voulons examiner la morphologie d’un neurone isolé suite à traitement.
- Cette approche peut permettre d’introduire de l’ADN dans une
structure ayant une certaine épaisseur comme une tranche de cerveau - Cette technique ne permet pas de transfecter des cellules in vivo
(exception foie et cellules de la peau) - L’inconvénient majeur de cette technique est qu’elle peut causer des dommages importants aux cellules—optimisation requise
9
Q
Comment se fait l’Introduction de l’ADN par une méthode chimique? (7)
A
- Utilisation d’un produit chimique pour faire rentrer l’ADN dans les cellules
- L’ADN chargé négativement peut former un macro-complexe avec un produit chimique chargé positivement
- Ces macro-complexes se fixent à la surface des cellules ce qui va promouvoir leur endocytose ou fusion avec la membrane
- Ces méthodes sont les plus couramment utilisées dans les laboratoires de recherche: très efficaces (haut pourcentage de cellules transfectées) et très
simples à utiliser. - Inefficaces in vivo et donc elles sont principalement utilisées en culture cellulaire
- L’expression du gène est transitoire (peut durer quelques jours). Ceci dépend du type cellulaire.
- Les produits chimiques les plus utilisés sont: phosphate de calcium et lipides de transfection
10
Q
Comment se fait la transfection par lipides? (8)
A
- Lipofection signifie transfection en utilisant des complexes de lipides pour introduire l’ADN dans les cellules
- Les membranes des cellules sont composées d’une couche bilipidique avec une surface hydrophobique du côté cytoplasmique et hydrophilique du côté extracellulaire
- La technologie de lipofection utilise des structures vésiculaires nommées liposomes qui ont la même composition que la membrane cellulaire
- Un liposome se forme autour de l’ADN
- Le liposome peut être endocyté dépendamment du type de liposome et du type cellulaire ou directement se fusionner avec la membrane cellulaire pour libérer l’ADN dans la cellule.
- L’avantage de la lipofection est que cette technique fonctionne avec un très grand nombre de cellules incluant les neurones
- Des réactifs sont vendus par plusieurs compagnies—transfection se fait en moins de 30 minutes et l’expression de gène débute quelques heures après la transfection.
- Comme la méthode phosphate de calcium, la lipofection est exclusivement utilisée en culture
11
Q
Comment se fait l’Introduction d’un gène en utilisant un vecteur viral? (10)
A
- Un virus s’attache à une cellule dans le but d’y injecter son matériel génétique. Ce matériel code pour des protéines nécessaires à la production du virus—les cellules infectées deviennent des usines à produire des virus.
- Les virus utilisés en laboratoire ont été modifiés et donc ils ne peuvent plus se multiplier tout seul dans la cellule
- Une région codante du virus est remplacée par le gène d’intérêt.
- Ce processus d’utiliser un vecteur viral qui ne peut pas se multiplier pour introduire un ADN dans une cellule se nomme transduction
- Les infections virales sont robustes, très efficaces et peuvent conduire à une expression à long terme.
- Les virus sont utilisés pour l’expression de gènes dans des cellules en culture, tranches de cerveau, des explants de tissu et dans le cerveau in vivo.
- Ils sont l’outil de choix pour l’expression de gènes dans le cerveau d’animaux
- Ils ont des inconvénients et des limites:
- Les cellules infectées peuvent commencer à exprimer le gène plusieurs jours (7 à 14) après l’injection (pas expression immédiate du gène)
- La taille du vecteur viral limite la taille de l’ADN qui peut y être inséré.
- Problème de biosécurité—l’expérimentateur doit faire attention pour ne pas s’infecter.
- Il existe plusieurs types de vecteurs viraux: ils varient en fonction de leur efficacité à infecter les cellules, niveau d’expression, la période d’expression, le temps où commence l’expression, la toxicité cellulaire et la préférence de la cellule hôte.
12
Q
Comment se fait la production de virus? (7)
A
- La technologie de recombinaison homologue est utilisée pour construire un virus qui va contenir le gène d’intérêt.
- Insérer le gène d’intérêt dans un vecteur (vecteur navette) qui contient les séquences nécessaires pour son incorporation dans une particule virale
- Co-transfection du vecteur navette avec le vecteur viral qui contient les séquences d’ADN qui codent pour les protéines virales: produit un virus qui ne peut pas se multiplier mais qui est fonctionnel et infectieux.
- La co-transfection est effectuée dans les cellules HEK 293T qui prolifèrent rapidement, se transfectent facilement et peuvent produire une grande quantité de virus.
- Un à deux jours après la transfection, les cellules produisent plusieurs particules virales et les libèrent dans le milieu extracellulaire
- La dernière étape de production de virus est de prélever le milieu et le centrifuger pour sédimenter les particules virales
- Le culot est resuspendu dans un tampon pour usage immédiat ou congelé pour usage ultérieur
13
Q
Qu’est-ce que l’adénovirus? (4)
A
- Adénovirus peut infecter les cellules en division et les cellules postmitotiques comme les neurones
- Il peut contenir un ADN de 7.5 à 30 kb
- L’ADN n’est pas intégré au génome—expression transitoire qui peut durer des semaines ou des mois
- très utile pour une expression transitoire dans les neurones—mais peut causer une réponse inflammatoire et la mort cellulaire
14
Q
Qu’est-ce que un virus adéno associé? (7)
A
- AAV est un virus qui est naturellement déficient pour se multiplier. Il a donc besoin d’un virus helper pour se multiplier—donc plus sécuritaire que les autres virus
- Il peut infecter les cellules en division et les cellules post-mitotiques comme les neurones
- Contrairement à l’adénovirus, il peut s’intégrer dans le génome ce qui permet une expression à long terme.
- Il est moins toxique pour les neurones que le virus adénovirus
- Sa production est très laborieuse
- Il peut contenir des ADN d’environ 5 kb
- besoin de 3 ADN pur faire AAV: gène intérêt, gènes viraux et herlper pcq AAV peut pas se multiplier
Utilise ADN viral prod pour transfection
15
Q
Qu’est-ce que le lentivirus? (6)
A
- Ce virus appartient à la famille de virus qui se nomment retrovirus qui possèdent un génome d’ARN plutôt que d’ADN
- Afin de générer des produits de gènes fonctionnels, le virus possède l’enzyme transcriptase inverse qui produit l’ADN complémentaire (ADNc) d’un ARN
- Quand une cellule endocytose un lentivirus, l’ARN est libéré et la transcriptase inverse produit l’ADNc. L’ADNc migre au noyau où il est intégré dans le génome de l’hôte– expression à long-terme.
- le lentivirus est capable d’infecter les cellules mitotiques et postmitotiques
–donc très utilisé en neurosciences - Lentivirus peut contenir un ADN de 8 kb
- vecteur navette avec gène intérêt, vecteur du virus, vecteur avec enveloppe de prot,
16
Q
Quelles sont les méthodes d’introduction d’ADN les plus utilisées en laboratoire?
A
- Culture cellulaire: transfection chimique, électroporation et virus
- Tranches de cerveau: virus et biolistique
- In vivo (animal): virus et électroporation (principalement chez les embryons)
17
Q
Qu’est-ce que la culture cellulaire? (12)
A
- Étudier le rôle de gènes particuliers, de protéines ou de différents types cellulaires.
- Co-cultures: deux types cellulaires qui sont cultivés ensemble (ex. une région du cerveau avec une autre—comment ils peuvent affecter le comportement de l’une de l’autre)
- Les co-cultures ont beaucoup été utilisées pour identifier les facteurs
impliqués dans la pousse de l’axone des motoneurones—protéines sécrétées de guidage axonal - Manipulations pharmacologiques: drogues ou produits chimiques pour activer ou inhiber des protéines, des canaux ioniques ou des récepteurs
- La culture cellulaire consiste à faire proliférer et à maintenir dans des conditions contrôlées des cellules qui ont été isolées d’un animal ou humain
- Les avantages d’utiliser la culture cellulaire sont les suivants:
- Simplifier l’environnement
- Conditions d’expérimentation plus faciles à contrôler
- Réduire les interactions avec d’autres organes qui pourraient exercer des effets sur les cellules d’intérêt.
- Performer en parallèle plusieurs expériences avec un nombre exact de cellules: difficiles in vivo
- Plus rapide, moins dispendieux et requiert un plus petit nombre d’animaux que les expériences in vivo
- Comme le but ultime est de mieux comprendre qu’est-ce-qui se produit in vivo, il faut interpréter et extrapoler les résultats in vitro avec prudence.
18
Q
Quels sont les 3 types de cultures cellulaires?
A
- lignées de cellules immortalisées
- Culture primaire
- Cellules souches
19
Q
Quels sont l’équipement et le milieu de culture de culture cellulaire? (3)
A
- Les conditions de culture doivent reproduire le plus possible l’environnement in vivo des cellules d’intérêt
- L’équipement et le milieu de culture doivent alimenter les cellules en oxygène, nutriments, facteurs de croissance et autres éléments nécessaires pour les maintenir en vie.
- Réactifs pour prévenir les contaminations: les cellules dans l’organisme ont le système immunitaire pour les défendre et dans le cerveau, il y a en plus la
barrière hémato-encéphalique
20
Q
Qu’est-ce qu’une lignée cellulaire immortalisée? (11)
A
- Ces cellules ont été modifiées pour pouvoir se diviser indéfiniment—donc peuvent être gardées en culture sur une longue période de temps.
- Ces cellules sont dérivées de différents types cellulaires qui ont des anomalies chromosomiques ou des mutations qui leur permettent de se diviser continuellement Ex.
tumeurs (neuroblastomes) - Étant donné que ces cellules se divisent continuellement, elles vont complètement recouvrir le surface du pétri—il faut donc les passer afin d’éviter une confluence de 100%. Il
s’agit de détacher les cellules du plastique en utilisant de la trypsine (protéase qui clive les protéines membranaires d’adhésion)—prendre un fraction des cellules et la transférer dans un autre pétri de culture - Très bien caractérisées étant donné qu’elles sont utilisées par plusieurs laboratoires
- En théorie, elles sont homogènes et constituent une population génétiquement identiques—
résultats constants et eproductibles - Plus faciles à cultiver que les cellules primaires (qui sont prélevées d’un animal à chaque culture)
- Étant donné qu’elles poussent rapidement et continuellement, il est possible d’extraire des quantités importantes de protéines pour des essais biochimiques
- Possible de produire une lignée qui exprime de façon permanente une protéine fusionnée à un tag
fluorescent—facilite la microscopie sur des cellules vivantes - l’inconvénient majeur de ces cellules: elles ne sont pas considérées comme normales– divisent continuellement et expriment un pattern de gènes qu’on ne retrouve pas dans des cellules in vivo (animal intact)
- Elles n’ont peut-être pas les fonctions d’une cellule normale
- Après une certaine période de prolifération continuelle, les caractéristiques des cellules sont modifiées—ne pas utiliser des cellules qui ont été passées
plusieurs fois
21
Q
Qu’est-ce qu’une lignée cellulaire immortalisée neurale? (5)
A
- Ces cellules proviennent de tumeurs et sont souvent génétiquement anormales
- Une lignée populaire est les cellules PC12 (pheochromocytoma cell line) qui sont dérivées de tumeurs de la glande surrénale
- À l’ajout de NGF (nerve growth factor) au milieu de culture, elles se
différencient de façon réversible en neurones—elles synthétisent la
catécholamine, dopamine et la norépinephrine et expriment la
tyrosine hydroxylase (TH) et choline acétyltransférase (ChAT), des
enzymes impliquées dans la synthèse de neurotransmetteurs. - PC12 ont été utilisées pour étudier les mécanismes moléculaires
impliqués dans la différenciation neuronale (développement de
l’axone) - Des lignées de neuroblastomes comme les cellules de souris Neuro2A peuvent exprimer TH, ChAT et AChE (acétylcholine) et sont beaucoup utilisées pour étudier la fonction de protéines spécifiques aux neurones.
22
Q
Qu’est-ce qui arrive si on ajoute du NGF à des cellules PC12?
A
quand ajoute NGF, prod prolongements qui ressemble à axone et si fait western, retrouve prot qui sont trouvées dans axones
23
Q
Qu’est-ce qu’une culture primaire? (7)
A
- La culture primaire et la culture de tissu utilisent des tissus prélevés
directement d’un animal - Ce type de culture permet d’isoler une population spécifique de cellules (ex. neurones ou cellules gliales)—d’examiner la fonction d’un type cellulaire spécifique
- Ce type de culture permet d’examiner différents aspects de la fonction des neurones (ex. les propriétés électrophysiologiques) et d’utiliser des agents pharmacologiques pour manipuler cette fonction
- La culture de cellules à partir d’organismes modifiés génétiquement permet d’étudier au niveau moléculaire les effets de la modification
- Extrapolation des résultats au cerveau intact plus pertinente que celle qui est faite à partir de lignées cellulaires puisque les cultures primaires ont été isolées du tissu animal.
- Survie limitée
- L’âge de l’animal à laquelle les cellules sont prélevées influence la santé et la robustesse des cellules—plus l’animal est jeune plus les cellules sont en santé et robustes
24
Q
Quelles sont 3 types de cultures primaires?
A
- cultures dissociées
- explants
- cultures de tranches de tissu
25
Qu'est-ce qu'une culture de cellules dissociées? (11)
- Le tissu neural est dissocié afin de permettre de séparer les cellules
individuellement—ces cellules seront alors mises dans un pétri soit directement sur le plastique ou sur des lamelles de verre—croissance en deux dimensions ou sur un substrat en trois dimensions
- Après avoir prélevé le cerveau, une région spécifique du cerveau est disséquée (ex. hippocampe)
- La région prélevée est alors dissociée mécaniquement et enzymatiquement afin d’obtenir une suspension homogène de cellules
- Les neurones sont par la suite mis en culture
- Les neurones retiennent l’identité de la région de laquelle ils ont été isolés—morphologie et les
propriétés moléculaires et
physiologiques. Ex. neurones pyramidaux de l’hippocampe,
motoneurones
- Dans un milieu de culture adéquat, les neurones peuvent être
maintenus pendant des semaines.—les neurones vont devenir des
neurones matures— développement de dendrites et de l’axone, formation de synapses, expression de récepteurs et de canaux ioniques spécifiques aux types cellulaires—production d’ activité électrique spontanée.
- Possible d’examiner des neurones individuels
- Beaucoup utilisées pour étudier les mécanismes moléculaires
impliqués dans la pousse de l’axone et des dendrites, la formation de synapses et les propriétés électrophysiologiques
- Perte de l’organisation (ex. couches du cortex cérébral) et des connections qui existent in vivo
- Petite quantité de cellules—ceci peut limiter les études biochimiques qui requièrent un grand nombre de cellules
- Des méthodes ont été développées pour isoler une population bien précise de cellules: a) immunopanning—un anticorps dirigé contre une protéine spécifique à un type cellulaire est attaché à la surface du pétri
afin de capturer ces cellules—utilisée pour purifier des précurseurs d’oligodendrocytes, les cellules ganglionnaires de la rétine et les motoneurones corticospinaux—b) cytométrie de flux
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Qu'est-ce qu'une culture de tranches? (5)
- Les tranches en culture conservent la structure et l’organisation de la région
dans le cerveau intact– épaisseur de 250-400micron
- Les tranches permettent d’avoir accès à des structures sous-corticales profondes telles que l’hippocampe et la thalamus—qui sont difficiles d’accès in vivo
- Des tranches aigues: tranches qui sont utilisées immédiatement pour des expériences l’électrophysiologie
- Cultures de tranches organotypiques: tranches qui sont maintenues en culture pour plusieurs jours ou semaines—changements morphologiques—permettent d’étudier la migration neuronale, formation de l’axone et formation de synapses.
- La culture de tranche nécessite un interface air/liquide pour un échange gazeux approprié à travers la tranche
27
Qu'est-ce qu'une culture d'explants? (5)
- Les explants sont une préparation intermédiaire entre les cellules dissociées et les tranches
- Bien qu’une organisation précise n’est pas conservée dans les explants, ils contiennent la même composition cellulaire que le tissu in vivo.
- Les cellules forment des groupes cohérents—plus petits que dans les tranches
- Les explants peuvent être submergés dans le milieu-pas d’interface pour échange gazeux comme les tranches
- Souvent utilisés en co-culture pour étudier la migration neuronale et la formation de neurites (dendrites et axone).
28
Qu'est-ce qu'une culture de cellules souches? (6)
- Les cellules souches sont des cellules pluripotentes qui ont la capacité de générer tous les types cellulaires retrouvés dans un animal et qui ont une capacité illimitée de se renouveler
- Elles sont comme les lignées cellulaires immortalisées puisqu’elles peuvent se diviser continuellement en culture mais elles sont aussi comme des cellules primaires puisqu’elles proviennent d’un organisme vivant.
- Les cellules souches sont classifiées selon leur source:
- A) cellules souches embryonnaires
- B) cellules souches adultes
- C) cellules souches pluripotentes induites (iPSC)
- Les cellules souches sont aussi classifiées selon le tissu duquel elles proviennent: neurales, hematopoietique, peau.
- Les cellules souches sont multipotentes et peuvent produire toutes les cellules du tissu duquel elles ont été isolées et sont capable de se renouveler. ex. les cellules neurales peuvent produire des neurones, astrocytes et oligodendrocytes et d’autres cellules souches neurales
- Les cellules souches doivent être cultivées dans un milieu qui contient des facteurs de croissance, EGF (epidermal growth
factor) et bFGF (basic fibroblast growth factor) afin de préserver leur multipotence et leur habilité à se renouveler
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Qu'est-ce qu'une culture de cellules souches embryonnaires? (10)
- Les cellules souches embryonnaires pluripotentes peuvent produire tous les tissus d’un organisme
- Elles sont dérivées des cellules de la masse interne du blastocyste (stade embryonnaire précoce)
- En les cultivant in vitro, elles sont maintenues dans un état de pluripotence en présence de facteurs qui les empêchent de se différencier
- Il est possible de recréer un environnement in vitro qui va leur permettre de se différencier en neurones
- En utilisant des conditions spéciales de culture, les cellules souches sont premièrement induites pour devenir des cellules progénitrices neurales, des précurseurs qui vont devenir des neurones
- Lorsque les cellules souches sont devenues des cellules progénitrices, l’ajout de molécules qui sont connues comme étant impliquées dans le développement des neurones in vivo vont être utilisées afin d’induire la différenciation d’un type particulier de neurones.
- La différenciation des cellules souches est suivie en examinant l’activation de facteurs de transcription impliqués dans le
développement et l’apparition de marqueurs connus pour promouvoir la différenciation d’un type de neurones spécifiques.
- La production des cellules souches embryonnaires et leur différenciation en un type de neurones spécifiques peut prendre plusieurs mois
- Les cellules obtenues peuvent être hétérogènes
- Très utiles pour investiguer les
mécanismes moléculaires impliqués dans les maladies neurodégénératives et pour tester des nouvelles thérapies
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Qu'est-ce qu'une culture de cellules souches neurales? (9)
- Elles sont extraites de régions du cerveau embryonnaire ou adulte où
normalement elles se divisent pour donner des neurones ou des
cellules gliales
- Les cellules neurales multipotentes ont la capacité de se renouveler et l’habilité de se différencier en tous les types de neurones
- Le cerveau d’embryons contient plusieurs cellules souches neurales
alors que le cerveau adulte en contient peu
- La capacité des cellules souches neurales à produire des neurones
diminue grandement avec l’âge.
- Les cellules adultes sont isolées de la zone sous-granulaire du gyrus
denté dans l’hippocampe et la zone sous-ventriculaire qui forme le mur
des ventricules latéraux
- Après la dissection, la région qui contient les cellules souches neurales est dissociée et une première étape de purification est effectuée par centrifugation
- Les cellules souches neurales vont proliférer dans le milieu de culture— passage
- En enlevant les facteurs de croissance du milieu, elles vont se
différencier en neurones, astrocytes ou oligodendrocytes
- Quand les cellules souches neurales sont cultivées en conditions nonadhérentes (en suspension) et en présence de facteurs de croissance elles forment des neurosphères– boules de cellules en division; permet de voir capacité à diviser, + neurosphères, + capacité à diviser est grandes
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Qu'est-ce qu'une culture de cellules souches pluripotentes induites? (9)
- Les cellules souches pluripotentes induites (iPS) sont des cellules différenciées qui ont été manipulées afin de les ramener au stade de cellules souches.
- On utilise des virus pour introduire 4 facteurs de transcription spécifiques dans des cellules somatiques telles que les fibroblastes qui vont permettre aux cellules de perdre leur phénotype différencié pour devenir des cellules souches pluripontentes
- Une fois que les iPS sont générées, elles sont testées afin de vérifier si elles possèdent les caractéristiques de cellules souches:
- Examiner le profil des facteurs de transcription et la présence de
marqueurs en utilisant des techniques d’immunocytochimie et de RT-PCR
- Le potentiel de ces iPS de se différencier est testé en les forçant à se différencier en un type cellulaire précis
- L’habilité de reprogrammer des cellules pleinement différenciées en cellules souches ouvre la possibilité de produire in vitro des cellules qui modèlent la maladie à partir des cellules du patient
- Ceci pourrait permettre de découvrir les mécanismes moléculaires impliqués dans des maladies telles que la maladie de Parkinson et la maladie d’Alzheimer
—cependant neurones produits à partir des cellules souches pluripotentes induites ont perdu leur signature du vieillissement (changements épigénétiques)—neurones jeunes
- Il est possible maintenant de produire des neurones qui retiennent leur signature du vieillissement par conversion directe des fibroblastes (biopsie cutanée) isolés de patients en neurones
- Ces cellules pourraient également être utilisées pour des thérapies—
remplacement de neurones qui ont dégénérés
