🐠 Criopreservação de Gametas e Embriões Flashcards
(8 cards)
Definição
A criopreservação é definida como “uma técnica de preservação de células, tecidos, órgãos ou organismos que utiliza temperaturas extremamente baixas (-196ºC) – a azoto líquido
Aplicações da Criopreservação na Aquacultura e Conservação
Esperma congelado para a rotina;
Estabelecimento de estratégias e espécies com problemas reprodutivos quando em cativeiro;
Criação de um banco de genes para desenvolvimento de programas de seleção;
Conservação de células de espécies em perigo de extinção - posterior recuperação.
Fertilização artificial;
Transporte de sémen; Comercialização;
Racionalização da reprodução;
Aumento da eficácia reprodutora (eliminar menos aptos)
Programação de cruzamentos;
Aproveitamento máximo do material reprodutor;
Sincronização da maturação;
Obtenção de híbridos;
Bancos de recursos genéticos;
Conservação do genoma;
Biodisponibilidade para testes.
Mecanismos de Dano Celular durante a Congelação
A formação de cristais de gelo é um dos principais desafios. “Quando uma solução aquosa arrefece abaixo do seu ponto de congelação há a formação de cristais de gelo”. Se a congelação é rápida, formam-se “cristais de gelo no interior da célula, causando a ruptura das suas estruturas e a morte”.
Se a congelação é lenta, as células desidratam, mas ficam “expostas a uma solução cada vez mais concentrada”, o que pode causar “danos severos (o denominado efeito solução), devido a alterações do pH do meio, stress osmótico, desnaturação de enzimas, etc.”.
Sem a adição de crioprotetores, “a criopreservação celular não seria possível… Os danos causados tornariam inviáveis todas as células a uma temperatura < –40 °C”.
Crioprotetores
Crioprotetores permeáveis: Penetram nas células (“glicerol, dimetilsulfóxido (DMSO), metanol, propanodiol ou etilenoglicol”). Atuam “como protetores de ambos lados da membrana”, induzindo a saída de água intracelular e diminuindo a temperatura de nucleação do gelo. Interagem com a membrana plasmática. No entanto, “podem ser tóxicos para as células produzindo graves danos celulares”
Crioprotetores impermeáveis: Substâncias de elevado peso molecular “incapazes de penetrar nas células, que exercem a sua ação crioprotetora externamente”. Provocam a desidratação celular e aumentam a viscosidade exterior, “reduzindo a formação de gelo e também diminuem a concentração de CPTs permeáveis necessária, reduzindo os efeitos tóxicos” (PVP);
Agentes de proteção da membrana: Substâncias sem efeito direto na congelação, que protegem a “estrutura mais sensível” (membrana plasmática). São de natureza lipídica ou lipoproteica, como gema de ovo, extratos proteicos de leite, BSA e extratos proteicos de soja.
Danos da criopreservação
Refrigeração ou “choque frio” (cold shock): Pode causar danos durante o arrefecimento, dependendo da sensibilidade do tipo de célula e da espécie (mais crítico para mamíferos do que para peixes de água fria).
Congelação em si: Produz cristais de gelo e stress osmótico.
Toxicidade dos crioprotetores: Afeta diferentes funções celulares.
Danos na Membrana Plasmática
A membrana plasmática é a estrutura mais danificada.
Atingindo o ponto de transição lipídico, a membrana desorganiza-se, perdendo a organização típica do “mosaico fluido”.
Isto afeta a permeabilidade e outras funções celulares (fecundação)
Criopreservação de Espermatozoides de Peixes
Fatores que contribuem para o sucesso incluem: “Pequena dimensão (4-6µm)”, “Número elevado por volume”, “Facilidade na recolha e manipulação”, e “Membrana única (fácil de desidratar e criopreservar)”.
A qualidade do esperma é avaliada por teste de mobilidade (>70% de mobilidade é apto).
O diluente inibe a motilidade e evita a desidratação.
Os crioprotetores (5-15% do volume total) são adicionados para minimizar danos.
Desafios na Criopreservação de Oócitos e Embriões de Peixes
Oócitos de peixes são “muito maiores e com mais quantidade de lípidos, são até à data, impossíveis de congelar”.
Os principais problemas incluem “desidratação insuficiente”, danos durante o “arrefecimento/congelação devido à relativamente grande dimensão dos ovos de peixe (1-6mm)”, e “a presença de membranas com diferentes permeabilidades à água”.
A entrada de crioprotetores é limitada, mesmo em ovos e embriões menores.
Os embriões de teleósteos possuem grande tamanho, um córion rígido de permeabilidade seletiva, e múltiplos compartimentos (embrião, saco vitelino). Esta estrutura torna “muito difícil conseguir o fluxo de água e CPTs adequado em todos e cada um dos compartimentos”.
A baixa relação superfície/volume complica a troca com o meio.
O saco vitelino, rico em lipoproteínas, é particularmente sensível à congelação e o seu comportamento osmótico difere do compartimento celular, dificultando a criação de um protocolo de congelação único.
