deel 2 : week 7 2e hc

Question 1

hoe te verkrijgen gen van interesse

Answer 1

• genomisch DNA(isoleren genomisch DNA-> PCR -> gen zoals in DNA
• cDNA -> isoleren RNA -> reverse transcriptase -> PCR -> gen als in mRNA (handiger)
• insert-vector (bestellen)

Question 2

doelen van PCR (polymerase chain reaction)

Answer 2

• selecteren (eerste cyclus, doe je met primers die aan weerszijde van ds DNA binden na denaturatie)
• amplificeren

Question 3

voorwaarde PCR

Answer 3

• sequentie weten van de uiteindes van het gen dat je wilt amplificeren (je moet zelf primers maken)
• DNA fragment niet meer dan enkele duizenden bp lang

Question 4

benodigdheden PCR

Answer 4

• primers
• DNA van interesse
• buffers (optimale omgeving)
• dNTPs

Question 5

gel-elektroforese

Answer 5

DNA-fragmenten scheiding op basis van grootte
- DNA moet gelabeld worden om zichtbaar te maken

Question 6

site-directed mutagenese (mbv PCR)

Answer 6

hele plasmide PCR’en met 1 nt anders (dmv primer met 1 nt anders is)

Question 7

hoe plasmiden vermeerderen

Answer 7

plasmide in bacterie krijgen -> kweken -> celwand kapot maken om plasmiden vrij te maken
in kweekmedium zit antibioticum

Question 8

hoe te controleren van plasmiden

Answer 8

• sanger sequencing
• banden patroon na digestie (gelelektroforese)

Question 9

sanger sequencing

Answer 9

PCR met dNTPs en ddNTPs (beide OH groepen weg) en met fluorescent kleurtje

Question 10

zichtbaar maken van eiwit

Answer 10

GFP gen zit in frame met p53 gen en wordt samen afgeschreven -> GFP-getagd eiwit

Question 11

maken knockdown-plasmide

Answer 11

ipv gen voor eiwit zet je gen voor short hairpin in plasmide. knockdown dmv RNA-interferentie (argonaut)

Question 12

definitie CRISPR-cas9

Answer 12

veranderingen aanbrengen op een exacte locatie in het genoom van een cel ‘gene editing’

Question 13

functies CRISPR-cas9

Answer 13

• knock out maken (bv vroegtijdig stopcodon)
• punt-mutatie aanbrengen
• specifiek recruteren transcriptie activator of transcriptie repressor (zit aan cas vast, cas knipt niet)

Question 14

bacteriële afweer : CRISPR-cas9 version

Answer 14

1. stukje virus-DNA in CRISPR-locus van genoom
2. (promotor voor de locus) transcriptie van virus-sequentie tot RNA
3. CRISPR RNA kan geknipt worden en die stukjes binden aan cas eiwitten
4. (na nieuwe infectie) : opsporen door guide-RNA, afbreken door cas-9

Question 15

lab techniek CRISPR-cas9

Answer 15

1. positionering cas9-enzym op juiste plek op DNA door guide RNA
2. cas9-enzym maakt ds breuk
3. cel repareert zelf ds breuk (NHEJ met INDEL of HDR)